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鸭病毒性肝炎(DVH)是雏鸭的一种烈性传染病,该病可由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型不同类型的鸭肝炎病毒(DHV)引起,目前我国流行的主要是鸭Ⅰ型病毒肝炎。DHV结构蛋白编码区(P1区)可以编码病毒特异性结构蛋白VP0(VP2和VP4的前体)、VP3和VP1,其中VP1蛋白(外壳蛋白)具有主要的型特异性抗原中和位点,是宿主的主要保护性蛋白。目前我国普遍采用接种鸭肝弱毒活疫苗的方式预防该病,但弱毒活疫苗普遍存在着毒力返强、自然散毒以及不便于运输保藏等缺点。核酸疫苗可诱导机体产生全面的免疫应答,并且对不同亚型的病原体具有交叉防御作用,同时具有安全、可靠、生产方便等优点,故被认为是继减毒、灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗之后的第三代疫苗。但该类疫苗目前存在保护率较低的弊端,克服这一弊端的较好方法就是添加分子佐剂。C3d片段是补体C3的裂解片段之一,是C3分子α链不能被蛋白酶再裂解并仍保持与抗原共价连接的最小片段,具有广泛的免疫学功能。因此,C3d被认为是基因疫苗的有效的分子佐剂。本研究以克隆的鸭补体C3d基因作为分子佐剂,直接与DHV的VP1基因连接,然后连接到真核表达载体上,构建了DHV VP1-C3d-pcDNA3.1分子佐剂基因疫苗,并对其免疫效果进行了研究。主要研究内容如下:试验一绍兴麻鸭补体C3d基因的克隆及序列分析采集经油乳剂灭活苗免疫刺激的绍兴麻鸭肝组织,用液氮研磨法提取肝细胞总RNA。根据GenBank上发表的其他动物补体C3序列,自行设计一对引物,RT-PCR扩增鸭C3d基因cDNA,克隆到pMD18-T载体,转化大肠杆菌BL21,酶切鉴定后测序。PCR结果显示,在991bp处有一明亮条带,与预期大小一致;酶切产物凝胶电泳后出现了2.7 kb和1.0 kb左右的载体片段条带和插入目的片段条带,证明PCR产物已成功连接至pMD18-T载体。经软件分析基因及其氨基酸序列结果证明,成功获得了鸭C3d基因;与鸡和人的C3d基因同源性比较结果分別为87.6%和46.9%,显示出明显的种属特异性。试验二DHV VP1基因的克隆和原核表达收集SPF鸡胚DHV尿囊液,采用液氮研磨法提取病毒总RNA,针对GenBank已登录的DHV-VP1基因序列,自行设计一对引物,RT-PCR扩增DHV VP1基因,克隆到pMD18-T载体,转化大肠杆菌BL21,筛选阳性克隆经PCR、酶切鉴定无误后将其克隆到表达载体PGEX-6P-1,PCR结果显示,在714bp处有一明亮条带,与预期大小一致;酶切产物凝胶电泳后出现了4.9 kb和7.1kb左右的载体片段条带和插入目的片段条带,证明与载体连接成功。转化大肠杆菌诱导表达,经SDS-PAGE分析证明目的蛋白得到表达,Western-blotting证实表达的目的蛋白具有良好的反应原性。试验三VP1-C3d-pcDNA3.1基因疫苗的构建及免疫效果的研究重新设计一对引物,将鸭C3d基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),构建完成包含分子佐剂C3d的真核表达载体C3d-pcDNA3.1;设计另一对引物,将DHV VP1段基因亚克隆至含分泌表达信号肽(tPA)序列的重组表达载体C3d- pcDNA3.1,克隆位置是CMV启动子下游与C3d序列上游的中间,构建完成鸭病毒性肝炎(tPA)-VP1-C3d-pcDNA3.1基因疫苗;用该疫苗对小白鼠进行免疫注射,通过检测抗体效价等指标,评价该疫苗的免疫保护效果。建立了检测抗DHV抗体的间接ELISA方法,并对该方法的各种反应条件进行了优化;以优化的间接ELISA方法对小鼠血清抗体效价进行了检测,结果显示VP1-C3d-pcDNA3.1基因疫苗组抗体效价平均值为6.2显著高于未添加分子佐剂基因疫苗组的2.4;病毒中和试验表明该基因疫苗对DHV病毒半数致死量的10倍量及100倍量攻击保护率为100%。