【摘 要】
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彩叶芋（Caladium bicolor）,又名花叶芋、五彩芋,天南星科花叶芋属,原产于南美洲热带地区的多年生草本植物,因其叶形独特、叶色丰富、姿态优美,而成为重要的室内盆栽和园林造景植物。叶色是彩叶芋最为重要的观赏性状之一,但其调控机理目前尚不清楚。花青素广泛参与植物色彩的形成,其代谢途径中结构基因的表达主要受R2R3-MYB、b HLH和WD40（MBW）复合体的调控。为探究彩叶芋呈色机理,本
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彩叶芋（Caladium bicolor）,又名花叶芋、五彩芋,天南星科花叶芋属,原产于南美洲热带地区的多年生草本植物,因其叶形独特、叶色丰富、姿态优美,而成为重要的室内盆栽和园林造景植物。叶色是彩叶芋最为重要的观赏性状之一,但其调控机理目前尚不清楚。花青素广泛参与植物色彩的形成,其代谢途径中结构基因的表达主要受R2R3-MYB、b HLH和WD40（MBW）复合体的调控。为探究彩叶芋呈色机理,本研究以彩叶芋‘红桃K’为材料,先筛选出其不同时期、不同部位的最佳内参基因,为今后在该物种中分子方面的研究提供基础。然后从其转录组数据库中筛选出一个与彩叶芋颜色变化相关的转录因子,通过RT-PCR技术克隆出该基因完整的最大ORF框,进行生物信息学和构建进化树分析,命名为CbMYB5。再通过q RT-PCR技术测定其在彩叶芋不同时期、不同组织的表达特异性。构建植物超表达载体,通过叶盘转化法转化彩叶芋,探究CbMYB5的基因功能。同时通过CRISPR/Cas9技术对彩叶芋中CbMYB5基因进行多位点基因敲除,初步建立彩叶芋的基因编辑体系。主要研究结果如下:1.根据彩叶芋转录组测序结果,以基因表达量TPM值较高且较稳定作为筛选标准,筛选获得6个常用候选内参基因EF-1α、GAPDH、CUL、UBC、MDH、RPL13,应用q RT-PCR技术获得候选内参基因在彩叶芋不同时期、不同组织样品中的Cq值。再利用ge Norm、Norm Finder、Best Keeper三个软件计算6个候选内参基因的稳定值,然后通过比较其稳定值结果可知,在其不同时期的最佳内参基因是RPL13、UBC和MDH;在其不同组织的最佳内参基因是GAPDH和UBC;在彩叶芋不同时期、不同组织表达均较稳定的是UBC。2.通过RT-PCR技术扩增获得CbMYB5基因完整ORF框,全长930bp,编码310个氨基酸。进行生物信息学及构建进化树分析发现其与红掌、玉米等调控花青素合成的R2R3-MYB型转录因子的亲缘关系最近,属于R2R3-MYB的C1亚组。不同组织和时期定量结果表明,CbMYB5基因在彩叶芋的根、种球、茎、叶中均有表达,在根和种球中表达量较高;在叶片未变红色时其表达量较低,开始变红时其表达量最高,然后随着叶片的衰老其表达量呈下降趋势,说明CbMYB5基因在彩叶芋不同时期、不同组织均有所表达,但其表达量具有一定差异,具有一定的时空表达特异性。3.运用CRISPR/Cas9技术对彩叶芋中CbMYB5基因进行多位点基因编辑,在彩叶芋中初步建立了高效的基因编辑体系,同时对CbMYB5基因功能进行验证。首先构建靶向CbMYB5基因的双靶点CRISPR/Cas9敲除载体,然后转化彩叶芋‘红桃K’,通过Basta抗性筛选,RT-PCR和电泳法鉴定,检测共获得12个在靶点位置发生不同类型基因突变的转基因株系,编辑效率为80.00%。分析发现,12个突变株系的突变类型包括碱基缺失、碱基替换和两个靶点间大片段碱基的插入与删除。在本次实试验所选的两个靶点中sg R2的中靶率为73.33%,远高于中靶率为26.67%的sg R1靶位点,表明sg R2能够更有效地与靶位点结合,所以选择合适的靶位点是基因编辑成功的关键因素之一。4.构建pCAMBIA1300-CbMYB5超表达载体,然后通过农杆菌介导的叶盘转化法转入彩叶芋‘红桃K’中,利用潮霉素抗性筛选,RT-PCR和电泳法鉴定,获得17个超表达CbMYB5阳性株系,对其中8个长势一致的株系进行q RT-PCR分析发现,该基因在超表达株系中的表达量显著上调;与野生型彩叶芋相比,超表达CbMYB5基因彩叶芋的叶片提前出现红色斑块。通过基因编辑技术获得12个CbMYB5基因突变株系,观察突变体表型发现,叶片红色斑块面积变小,并且变色期推迟。然后对超表达株系和突变株系花青素合成途径相关结构基因定量检测发现,超表达植株中Cb CHS、Cb F3H、Cb DFR和Cb ANS的表达量显著上调,CbMYB5基因突变体中Cb CHS、Cb CHI、Cb F3H、Cb DFR和Cb ANS的表达量均显著下调。以上结果表明:CbMYB5基可能通过调控花青素合成途径相关结构基因的表达来正向调控花青素的合成与积累,进而调节彩叶芋红色叶斑的形成。
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