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我国是水产养殖大国,在水产养殖业蓬勃发展的同时,水生动物病害给水产养殖行业蒙上阴影。近年来鱼类诺卡氏菌病已经成为水产养殖业中的严重病害,当水产动物体质虚弱、免疫力低下时,病原菌可通过鳃、饲料或者伤口等进行感染。病鱼表现为腹部膨大,内脏器官常弥漫性分布有致密肉芽肿,该病的感染率和死亡率都比较高,目前尚缺乏有效的防治措施,给水产养殖行业带来巨大损失。近年来鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)已成为鱼类诺卡氏菌病的主要病原,约39种海淡水养殖鱼种深受其害,然而关于鰤鱼诺卡氏菌的致病机理及其毒力因子目前尚不明确。通过对鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503全基因组进行分析,预测ORF6296编码一种谷氨酰内肽酶(Glutamyl endopeptidase)同源类似物,命名该蛋白为Glu NS。生物信息学分析Glu NS是鰤鱼诺卡氏菌的潜在分泌型毒力因子。本研究克隆了Glu NS基因,并对其功能进行分析;对鰤鱼诺卡氏菌胞外产物进行了质谱鉴定;构建了Glu NS基因的亚细胞定位和过表达重组质粒,研究Glu NS在鱼类细胞中的亚细胞定位和致病功能;利用同源重组构建Glu NS基因缺失株和回补株,探究Glu NS缺失株和回补株在鱼体水平和细胞水平上细菌致病性变化。本研究旨在通过对定位于鱼类细胞线粒体的鰤鱼诺卡氏菌Glu NS开展研究,以期阐明该蛋白在鰤鱼诺卡氏菌感染致病中的功能,促进更深入地认识鰤鱼诺卡氏菌的致病机制,并为鱼类诺卡氏菌病的防治提供理论基础。主要的研究结果如下:1.成功克隆鰤鱼诺卡氏菌谷氨酰内肽酶(Glu NS)基因,生物信息学分析其属于谷氨酰内肽酶同源类似物,无明显信号肽位点,Glu NS属于链霉菌组谷氨酰内肽酶。质谱鉴定证明Glu NS为分泌蛋白,在鱼类细胞中与线粒体部分共定位。过表达Glu NS蛋白48 h后能诱导细胞出现凋亡小体,表明细胞发生凋亡。而且caspase-3蛋白活性显著激活,线粒体膜电位降低,这些结果证实Glu NS可诱导细胞可能通过线粒体途径发生凋亡。2.利用同源重组原理构建Glu NS缺失株和回补株,对缺失株和回补株的多种性状和野生株N.seriolae ZJ0503进行比较。结果发现,基因缺失对细菌的在液体培养下无差异,而在固体培养条件下,缺失株出现生长滞后现象。3.探究Glu NS基因缺失对于鰤鱼诺卡氏菌致病性的影响,(1)在鱼体层面,对杂交鳢腹腔注射进行攻毒实验,测定不同菌株的半致死浓度(LD50)。结果显示缺失株的半致死浓度显著高于野生株,而回补株与野生株无显著差异。鰤鱼诺卡氏菌Glu NS缺失株致病性降低,表明Glu NS是与鰤鱼诺卡氏菌致病性相关的毒力基因。(2)在细胞层面,研究了Glu NS对鰤鱼诺卡氏菌诱导呼吸爆发、细胞侵染能力的影响。结果发现Glu NS对鰤鱼诺卡氏菌逃避巨噬细胞吞噬、抑制巨噬细胞呼吸爆发的影响不大;缺失Glu NS基因对鰤鱼诺卡氏菌侵染细胞能力无明显影响。综上,Glu NS可能并不是通过影响巨噬细胞功能、侵染宿主细胞这两方面发挥其毒力因子功能的。