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研究背景及目的结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）作为世界第三大高发上皮组织来源恶性肿瘤,其发病率和致死率已经排在我国常见恶性肿瘤的前五位,并已经成为我国主要的公共健康问题之一。正常上皮细胞发生基因突变后逐渐转化为恶性肿瘤细胞,并适应和刺激机体产生了肿瘤细胞赖以生存的环境（Tumor microenvironment,TME）,研究表明,癌症的浸润和转移不仅依赖CRC肿瘤细胞的自身属性,还与TME功能关系密切,可以说基因突变的发生及其间质成分的支持始终贯穿了CRC的整个起病和发展过程。RNF43作为经典Wnt通路的负调节因子,可泛素化赖氨酸残基降解Frizzled受体,起到抑制肿瘤发生、进展的作用。多个研究表明肿瘤抑癌基因RNF43在子宫内膜癌（Endometrial cancer,EC）、胃癌（Gastric cancer,GC）及西方CRC患者中存在较高频率突变（超过15%）。但我国CRC患者中是否存在该基因的高频突变尚未可知,因有研究表明基因突变频率也会受到人种差异的影响。而我们在前期研究中发现RNF43存在Arg117单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism,SNP）,（编号rs2257207,RNF43 X117密码子存在Arg和His两种）,而氨基酸构成不同则会影响蛋白功能,最终对肿瘤的发生和预后产生影响。癌症相关成纤维细胞（Caner associated fibroblasts,CAFs）作为TME中的主要成分,可合成大量胶原纤维保护CRC细胞免于化疗药物攻击、同时分泌多种因子参与肿瘤进展。基于CRC的转移侵犯与肿瘤基质密不可分的理论,靶向调节或影响CAFs功能或可为CRC治疗和研究提供了新的方向。研究发现BET蛋白（Bromodomain and extra-terminal,BET）抑制剂JQ1可特异性结合BET含溴结构域,通过影响细胞周期和凋亡来治疗乳腺癌、白血病等多个肿瘤,但其治疗作用都是针对肿瘤细胞本身,对CAFs功能有无影响则很少提及。因此,本课题主要研究以下三个问题:一、研究中国CRC患者人群中RNF43的突变率及其编号为rs2257207 SNP组成差异影响预后的机制;二、掌握CRC患者原代成纤维细胞的分离、培养和鉴定技术;三、研究BET蛋白小分子抑制剂JQ1抑制CRC和CAFs细胞HGF/MET通路抗肿瘤的新机制。方法我们从CRC样本库内随机选择了在2010年2月至2012年12月就诊于我院的177名CRC患者结肠癌组织和血液配对样本,分别对其进行全基因组DNA提取、RNF43片段扩增（含Arg117和Gly659区域）、Sanger测序,并收集姓名、性别、年龄、肿瘤分期、预后信息等临床基本资料。测序结果由3位研究员独立调阅和判读,统计分析RNF43的突变率及X117位点SNP与患者预后的关系;最后在Arg117位点突变的HCT116细胞系中分别过表达RNF43 R117R、RNF43R117H,研究其影响患者预后的机制。为了研究JQ1对HGF/MET通路的影响,我们首先利用qPCR（Quantitative PCR）和Western blot在4种CRC细胞系（sw480、sw620、RKO、HCT116）中检验了JQ1对MET（MET proto-oncogene,receptor tyrosine kinase,又称为HGFR）的影响。接着利用酶消法从CRC患者手术标本中获得肠道组织中的NFs（Normal fibroblasts）和CAFs,随后用qPCR和ELISA分析了肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor,HGF）在两类细胞中的表达量以及JQ1对CAFs功能的影响。最后利用成纤维细胞培养上清和外源性hHGF刺激HCT116研究CAFs是否可以促进CRC细胞迁移。结果通过对177例CRC患者组织及血液样本测序,我们共得到351个测序结果,其中只有4例患者存在RNF43突变（1例Arg117位点、3例Gly659位点）,占总人数的2.26%。RNF43 X117 SNP（编号rs2257207）与预后相关,G/G纯合子患者总体生存率（Overall survival,OS）较另一组（G/A杂合子、A/A纯合子）稍差（OS,HR 1.894,95 CI 1.033-3.829,P<0.05）,而无瘤生存率（Disease-free survival,DFS）无统计学差异,单因素与多因素Cox回归分析显示肿瘤部位可作为预测OS、DFS的独立因素。HCT116分别瞬时转染RNF43R117H与RNF43R117R过表达质粒后,前者Wnt通路下游c-Myc、CCND1表达量下调更加明显,说明两者功能存在一定程度的差异。在BET蛋白抑制剂影响HGF/MET信号通路方面,课题组用JQ1分别处理上述4种CRC细胞系后可见肿瘤细胞MET蛋白和mRNA水平都有所下降。同时利用酶消法,我们成功从CRC患者组织样本中分离了NFs和CAFs,αSMA和Vimentin免疫荧光显示其表型和纯度可以满足实验所需,对其分别进行qPCR和ELISA检测后,课题组发现CAFs细胞HGF表达量较NFs明显上升高。随后我们使用JQ1对CAFs进行处理,证明了JQ1可以下调CAFs中HGF的合成和分泌。同时利用NFs、CAFs及CAFs+JQ1处理后的细胞培养上清和外源hHGF去刺激HCT116细胞,结果表明成纤维细胞可促进CRC细胞迁移,其中CAFs刺激能力最强,且JQ1能抑制CAFs生物学功能。而流式细胞仪分析显示,JQ1可通过下调经典明星分子c-Myc来抑制CAFs细胞增殖,而不增加细胞凋亡。结论综合文献报道与我们自己的研究可以说明,不同种族存在RNF43的突变是确定的,但其突变率的高低并不是一致的。中国CRC患者RNF43至少在R117和G659两个位点上突变率较低,仅2.26%。RNF43 X117 SNP（编号rs2257207）蛋白构成差异与我国CRC患者预后相关。我们的结果证明了正常基因的多态性会影响蛋白质功能、并最终影响CRC患者预后,为CRC基础研究提供了一些新的思路和方向。BET蛋白抑制剂JQ1可下调CRC肿瘤细胞MET的表达,而BRD4是抑制MET表达的关键分子。我们成功利用酶消法获得了CRC患者原代成纤维细胞,且发现CAFs中HGF表达量较NFs明显升高。JQ1不仅能抑制CRC肿瘤细胞,还可通过下调c-Myc抑制CAFs细胞增殖、影响CAFs的生物学功能并减少其HGF的分泌,间接影响肿瘤细胞的迁移能力。总之,JQ1可双向抑制CRC肿瘤细胞和CAFs而干扰HGF/MET信号通路功能,是抑制CRC的重要靶点。