论文部分内容阅读
环境暴露可能会导致生物体DNA损伤或表观修饰异常，这些异常如果未能得到及时、有效地修复，则可能进一步发展成为疾病甚至癌症，因此基因组中DNA损伤或表观修饰异常的分析对于相关疾病的检测和预防具有重要意义。但是通常发生损伤和表观修饰异常的碱基含量都很低(约占整个基因组碱基的0.001％～0.000001％)，如何从基因组大量正常碱基中准确快速获取这些异常碱基的类型、结构、丰度和位置分布等信息，是核酸分析中一个具有挑战性的工作。液相色谱-质谱技术(LC-MS/MS)具有高灵敏度和高分辨率的优点，可同时鉴定多种损伤和修饰异常碱基的类型，含量水平和相关转化路径等信息，是核酸研究的一个有力手段，近年来发展迅速。然而LC-MS/MS用于核酸分析的前处理技术上仍面临挑战，如:常规自由溶液多酶体系适用于短链核酸片段的酶切，对庞大的基因组DNA酶切效率不高，速度慢(8-12h);溶液酶切经历酶灭活、超滤萃取和除盐等过程，周期长、操作繁琐，易引进新碱基修饰（如氧化损伤）或结构转变，增加假阳性风险等。 本研究制备的固定化酶级联反应器，可将基因组DNA一步酶解为单核苷，具有酶切效率高、速度快、封闭体系干扰小等优势，可有效解决自由溶液多酶体系的问题。另外将级联酶反应器与LC-MS/MS联用，发展了快速检测痕量损伤和修饰异常碱基的高灵敏方法，用于细胞和临床样品中核酸异常标志物的分析。以多孔的毛细管硅胶整体柱为载体，将三种DNA酶:超级核酸酶(Bezonase)、蛇毒磷酸二酯酶(SVP)、碱性磷酸酶(ALPase)固定于其上，制备了三酶级联反应器。该整体柱具有多孔结构、比表面积大和低背压等特点，因此通过低压微量注射泵、手推泵等可将DNA样品直接注入酶反应器进行酶解。 随后，表征级联酶反应器的效能。结果发现，级联酶反应器具有酶切效率高、速度快的优势，可将基因组DNA在10min内酶解为单核苷(92.0～96.5％)，相对于常规自由溶液酶切体系需要8-12h，该方法显著提高酶切效率和速度。此外，级联酶反应器具有优异的稳定性，重复使用20次和1月的保存期内其酶解效率始终保持在80％以上。经过级联酶反应器酶解后的样品不用热变性或超滤除酶，可直接进入质谱进行目标核苷产物的定性或定量分析。 为检测发展的级联酶反应器-LC-MS/MS联用方法用于实际样品中基因组DNA痕量损伤和修饰碱基分析的应用。培养并提取暴露不同剂量的2，3，5，6-四氯-1，4-苯醌(TCBQ)24h后人膀胱癌细胞T24的基因组DNA，分别通过溶液酶解体系12h和级联酶反应器10min酶解，将产物通过HPLC-MS/MS分析，检测其中5羟甲基胞嘧啶(5hmC)的水平变化。结果两种酶解方式所获得的5hmC水平的无论从绝对量还是变化趋势上都是一致的:与对照组相比，TCBQ暴露使得T24细胞的基因组DNA中5hmC水平显著提升（最大提高了近2.3倍，从17.4/106dC到40.2/106dC），且提高效果与TCBQ的暴露浓度（1-20μM）呈现剂量效应关系，证实了酶反应器对实际样品中基因组DNA痕量损伤和修饰碱基的分析能力。 本文的创新点在于:制备的Benzonase-SVP-ALPase三酶级联反应器可以实现10min内基因组DNA的高效全酶解，且该酶反应器稳定性良好，对实际样品基因组DNA的痕量损伤和异常修饰分析具有广阔前景。为阐明药物、环境因素或生物体内源性因素引起的痕量核酸修饰及损伤的分子识别、修复及突变机制提供了有力的研究手段。