肥胖是很多慢性疾病(高血压、糖尿病等)的诱因和基础,对全球人类健康产生巨大的威胁。目前,对肥胖成因的研究大多归结于遗传因素、不良的饮食习惯以及缺乏身体活动,治疗也主要是针对肥胖或/和有肥胖先兆的人体/动物进行。但在人们普遍注意健康生活方式的今天,其发病率仍逐年迅猛增加,提示有其他新的重要致病机制存在。在对低出生体重儿和宫内发育迟缓胎儿的研究中发现成年后出现肥胖及代谢综合征的几率是正常儿童的5.75倍,提示胎儿的宫内发育是影响成年后肥胖的独立因素。因此,着眼于生命早期,研究探讨肥胖/超重发病的新病因,对肥胖及其相关代谢疾病的防治具有重大意义。本室前期研究发现,母体孕期炎症刺激能导致子代发生高血压并伴有体重明显增加[1,2]。同时,肥胖及其相关代谢综合征又与高血压的发生、发展高度相关[3]。mi RNAs是长度约为23个核苷酸且具有m RNA调控功能的单链非编码RNA,它在转录后水平的基因调控中起着重要作用。多个高通量研究表明一些mi RNAs在代谢性疾病中差异表达,相关mi RNAs在糖尿病和高脂模型中的调控作用已被报道[4,5],对mi RNAs在疾病中调控作用的研究受到广泛关注。本室前期成功创建的孕期炎症刺激致子代动物高血压和肥胖模型,为本课题的开展奠定了良好的基础。但是,孕期炎症刺激子代小鼠肥胖的类型、对子代脂肪发育的影响、mi RNAs的变化,以及mi RNAs变化与子代脂肪发育改变的关系等科学问题均有待阐明。为此,本文即对上述几个问题进行了初步研究,以期为深化对肥胖及相关疾病发病机制的认识提供新思路,并为寻找新的防治分子靶标提供实验依据。方法:1.孕期炎症刺激对子代小鼠体重及部分代谢指标的影响的研究方法1.1 8w龄C57小鼠,雌:雄=2:1的比例同笼过夜,第二天7:00前观察阴栓,确定孕鼠。1.2孕11d给予孕鼠一次性腹腔注射脂多糖(LPS)(75μg/kg),对照组注射0.2ml的生理盐水。分别于子鼠4w、8w、12w取材。1.3两组子鼠从出生开始进行体重监测,每2w测量一次体重(g)和体长(cm),直到12w。并计算对应Lee’s指数(Lee’s指数=[体重(g)×103/体长(cm)]1/3)。1.4子鼠4w、8w和12w时,断颈处死。取雌鼠肾周脂肪、雄鼠附睾脂肪,称重并计算脂肪系数(脂肪系数=脂肪湿重/体重×100)。1.5对4w、8w、12w的子鼠,麻醉后进行Micro-CT检测,利用Mimics10.01分析皮下脂肪、内脏脂肪分布情况。1.6子鼠4w、8w和12w取血清,检测血总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)含量。1.7对4w、8w及12w的子鼠禁食12h后检测空腹血糖。然后,灌服2.5g/kg的20%的葡萄糖溶液,分别于灌服后0.5h、1h、2h及3h检测血糖。2.孕期炎症刺激致子代小鼠肥胖的机制研究的研究方法2.1取4w、8w、12w子鼠内脏脂肪组织。采用常规石蜡包埋后进行HE染色。在40×显微镜下,随机选取8-10个视野进行观察检测,并统计脂肪细胞直径大小(μm)。2.2 Real-time PCR法检测4w、8w、12w子鼠脂肪组织中脂肪细胞分化标志物的基因表达水平。(CEBP/α、CEBP/β、CEBP/δ、a P2、PPARγ)2.3 Real-time PCR法检测4w、8w、12w子鼠脂肪中mi R-143、mi R-320、mi R-375、mi R-126、mi R-218、mi R-16、mi R-224、mi R-423、mi R-200a、mi R-200b、mi R-200c、mi R-145、mi R-214、mi R-351、mi R-30c、mi R-30d、mi R-30e、mi R-199a、mi R-23b、mi R-290的表达水平。2.4 Real-time PCR法检测mi R-224、mi R-200b、mi R-30d在子鼠附睾脂肪组织的脂肪间质血管成分(SVF)及成熟脂肪细胞中的表达水平。2.5 Real-time PCR法检测mi R-224、mi R-200b、mi R-30d在子鼠附睾脂肪SVF部分各个亚型中的表达水平。2.6用MTT法、Ed U法分别检测mi R-200b、mi R-224、mi R-30d对3T3-L1细胞增殖的影响。2.7油红O染色观测3T3-L1分化情况,Real-time PCR法检测每组中脂肪分化标志物的表达水平。结果:1.母体孕期炎症刺激对子代小鼠体重及部分代谢指标的影响1.1与NS组相比,LPS组4w雌鼠体重显著升高(p<0.05),雄鼠体重增加非常显著(p<0.01);6w~12w,雌鼠及雄鼠体重均显著升高(p<0.01)。与NS组相比,4w LPS组雌鼠Lee’s指数显著增高(p<0.05);雄鼠升高非常显著(p<0.01);6w~12w,雌雄鼠Lee’s指数均显著升高(p<0.01)。1.2 4w时,LPS组子代雄鼠附睾脂肪湿重显著高于NS组(p<0.05),附睾脂肪系数有升高趋势但无显著性差异。8w和12w LPS组子代小鼠肪湿重和脂肪系数均显著高于NS组(p<0.05)。1.3 micro-CT结果显示,4w、8w和12w子代雌/雄性小鼠,LPS组内脏脂肪显著高于NS组(p<0.01)。而皮下脂肪的变化并无显著性差异(p>0.05)。1.4与NS组相比,4w/8w/12w LPS组子代小鼠空腹血糖无显著性差异,但在口服糖耐量实验中,LPS组子鼠的血糖应答曲线下面积(AUC)显著高于NS组(p<0.01),表现出糖耐量不良。1.5与NS相比,LPS组4w雌鼠血清TC、LDL显著升高(p<0.05),雄鼠血清TC、TG、LDL和HDL显著升高(p<0.05);8w雌鼠血清TC和HDL显著升高(p<0.05),雄鼠血清TG、TC和HDL显著升高(p<0.05);12w雌鼠血清TC和HDL显著降低(p<0.05),雄鼠血清TC、TG、HDL和LDL显著性升高(p<0.05)。LPS组子代小鼠表现出血脂异常。2.孕期炎症刺激致子代小鼠肥胖的机制研究2.1与NS组相比,LPS组4w子代小鼠脂肪细胞形态无明显变化(雌鼠肾周脂肪细胞,雄鼠附睾脂肪细胞);8w子代小鼠脂肪细胞直径显著增大(p<0.05);12w子代小鼠脂肪细胞直径增大非常显著(p<0.01)。2.2与NS组相比,LPS组4w子鼠脂肪分化标志物a P2、PPARγ、CEBP/α、CEBP/β和CEBP/δ的表达均无显著性差异(p>0.05);8w子鼠脂肪组织中CEBP/δ表达显著上调(p<0.05),a P2、PPARγ和CEBP/α表达上调非常显著(p<0.01),CEBP/β表达无明显变化;12w子鼠脂肪中a P2、PPARγ、CEBP/α和CEBP/δ表达显著性上调(p<0.01),CEBP/β表达无明显变化。2.3与NS组相比,LPS组4w子鼠脂肪组织中1个mi RNAs(mi R-199a)显著性上调(p<0.05),8个mi RNAs显著性下调(p<0.05);8w子鼠脂肪组织中包括mi R-199a等17个mi RNAs显著性下调(p<0.01);12w子鼠脂肪组织中17个mi RNAs显著性下调(p<0.01),其中15个与8w变化一致,另有mi R-30d、mi R-30e显著性下调表达。2.4根据mi RNAs的差异表达统计分析结合文献报道及生物信息学分析,选择mi R-200b、mi R-224和mi R-30d为研究对象。与NS组相比,mi R-200b、mi R-224和mi R-30d在LPS组子鼠脂肪的成熟脂肪细胞中的表达无明显变化;但在LPS组子鼠脂肪基质血管成分(SVF)部分的表达显著降低(p<0.05)。2.5利用流式细胞术分选出SVF部分各细胞亚型:内皮细胞、前脂肪细胞/脂肪间质干细胞、巨噬细胞和淋巴细胞。与NS组相比,mi R-224在LPS组前脂肪细胞/脂肪间质干细胞中表达显著降低(p<0.05),而在其他细胞亚型的表达无显著差异;mi R-224、mi R-30d在各细胞亚型的表达均无显著性差异。另外,LPS组SVF中巨噬细胞比例明显升高。2.6选择前脂肪细胞3T3-L1为研究对象。发现仅mi R-200b有显著性抑制前脂肪细胞增殖的作用(p<0.05),而anti-mi R200b有促进增殖的趋势。2.7与阴性对照相比,仅anti-mi R224有显著性促进前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的作用;而mi R-224有抑制前脂肪细胞分化的趋势。其他组别未见明显作用。结论:1.孕期炎症刺激导致子代小鼠体重增加是以内脏脂肪增加为特征的中心性肥胖,并出现血脂异常和糖耐量下降。2.孕期炎症刺激导致子代小鼠出现脂肪发育异常变化。3.mi R-200b有抑制前脂肪细胞增殖的作用,anti-mi R224有促进前脂肪细胞分化的作用。mi R-224在子代小鼠脂肪原代前脂肪细胞中表达下调。4.孕期炎症刺激导致子代小鼠肥胖的机制可能与脂肪发育异常及mi RNAs表达变化有关。