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苹果病毒病在世界各地广泛分布,影响严重,具有危害性强、传播扩散快和难以治愈的特点。苹果病毒破坏和干扰果树正常生理功能,导致树势减弱,产量降低,果实品质下降,造成严重的经济损失。
本论文针对我国四种主要苹果病毒苹果花叶病毒(Apple mosaic virus,ApMV)、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leafspot virus,ACLSV)、苹果茎痘病毒(Apple stempitting virus,ASPV)和苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)进行研究。
主要取得了以下研究结果:
1.建立了能够稳定应用于田间四种苹果主要病毒检测的RT-PCR体系:确定了适合苹果总RNA提取的最佳提取方法一RNA改良提取法;对用于四种病毒RT-PCR检测已发表引物和自行设计引物进行筛选;确定了最佳引物,并对各病毒RT-PCR检测体系和程序进行优化。优化的RT-PCR检测体系能够对四种苹果病毒进行周年检测,ASPV、ASGV、ACLSV和ApMV检测灵敏度分别为总RNA模板的2,000x稀释液、5,000x稀释液、10,000x稀释液、200x稀释液。
2.通过对我国13个省(市/区)327份材料进行检测,明确了我国苹果产区四种病毒的发生及分布:四种苹果病毒病在我国苹果产区普遍发生,ApMV、ASPV、ASGV和ACLSV的平均侵染率分别为80.1％、65.1%、73.7%和69.7%。病毒混合侵染现象普遍,两种病毒混合侵染率为16.5%,三种病毒混合侵染率为51.1%,四种病毒混合侵染率为26.9%。其中ApMV+ASGV+ACLSV+ASPV复合侵染率最高,为26.9%,其次为ApMV+ASGV+ACLSV,侵染率为16.8%;ACLSV+ASPV混合侵染率最低,为0.3%。
3.建立了能够同时检测四种苹果病毒的多重RT-PCR检测体系:利用携带ASPV、ASGV和ACLSV的组培苗及田间ApMV染病组织为材料,对四种病毒的RT-PCR检测引物组合进行筛选,在此基础上加入苹果内源基因引物,并对检测体系和程序进行优化。结果表明:引物ASGVs-5/ASGVs-3’、2002ASPV-5/2002ASPV-3’、ACLSV4-5/ACLSV4-3’及EF-1a-5/EF-1a-3’组合能够同时特异性检测四种苹果病毒和苹果内源基因。ASPV、ASGV、ACLSV和ApMV检测灵敏度分别达到2,000x、1,000x、1,000x和100x总RNA模板稀释液。最后通过检测田间样本明确了所建立的多重RT-PCR检测体系在田间应用的可能性。
4.初步明确了我国苹果上ACLSV的分子变异情况:对来源于我国不同地域、不同品种的54个ACLSV分离物的部分CP序列进行了测定,与已报道的66个ACLSV分离物进行序列同源性比较和系统进化树分析。发现我国苹果上ACLSV分离物处于2个不同组群,组群Ⅰ包含了与已报道的“B6型”分离物亲缘关系较近的38个分离物,其中20个分离物CP氨基酸变异位点较为特殊,在系统进化树中与已报道的“B6型”分离物处于组群Ⅰ的不同亚组中。组群Ⅱ包含与已报道“P-205型”分离物亲缘关系较近的16个分离物。经过对来源于不同寄主、不同种植地域、不同苹果品种的ACLSV分离物进行分析,发现ACLSV的变异与寄主种类有一定的相关性,与种植地域无明显相关性,与苹果品种可能有相关性。