胃癌在全世界范围内是发病率最高的癌症之一,但其发病机制不清,目前尚不能有效地预防其发生及治疗。肿瘤转移是恶性肿瘤的重要生物学特征,肿瘤转移的研究始终是一个令人关注的重要课题。肿瘤转移涉及许多基因的改变,目前已经发现与肿瘤转移密切相关的基因有MMP,NM23、TIMP1、TIMP2,WDNM、H2-K、INOS、KISS1,CAV1、S100A4、MTA1、KIT和MCAM等。细胞黏附分子E-cadherin蛋白是维持上皮细胞极性及细胞间连接的糖蛋白,其结构和功能的异常可导致细胞间黏附能力减弱,在肿瘤的浸润和转移中发挥重要的作用。S100A2是S100基因家族中的一员,是该蛋白家族中唯一与肿瘤生长呈负相关的蛋白质分子。S100A2基因作为候选抑癌基因,在许多恶性肿瘤中表达明显降低,在肿瘤的发生发展中起着非常重要的作用。Tsai等研究发现S100A2的表达能减弱肿瘤细胞的运动性和侵袭能力,与肿瘤的转移及浸润密切相关。　　 表观遗传(epigenetic)的变化是真核基因组一种独特的调控机制,主要通过DNA(DNA methylation)甲基化、RNA沉默和组蛋白修饰等方式来控制基因的沉默。DNA甲基化是基因组内一种重要的碱基修饰现象,是重要的表观遗传调控方式之一,在胚胎发育、遗传印记和x染色体失活中发挥着重要的作用。最近10多年来,通过对DNA甲基化模式的研究,人们发现许多种类的癌细胞都有着异常的DNA甲基化行为,表现为基因组范围的低甲基化和特异位点的高甲基化。基因组范围的低甲基化可通过影响染色体的稳定性而启动癌的发生,实验表明鼠单纯DNA低甲基化可以诱导T淋巴细胞瘤。特异位点的高甲基化是指肿瘤抑制基因常常被过量地甲基化而导致失去活性,而被看作是抑癌基因沉默的“第二次打击”事件。如VHL,HIC-1,Rb,P15,P16等基因在许多肿瘤中发现他们的启动子区发生异常的甲基化。　　 RNAi(RNA interference)技术是近年发展起来的基因沉默技术,是利用双链RNA(dsRNA)特异性地降解与其同源的mRNA序列,从而特异性地阻断相应基因的表达。RNAi作为一种替代基因敲除的简单有效的工具,在功能基因组学研究、基因治疗等领域受到越来越多的重视。　　 目的：　　 本研究采用半定量RT-PCR方法及免疫组化方法检测了不同进展时期的胃癌组织标本、配对癌旁组织及正常胃黏膜组织E-cadherin和S100A2的表达情况,分析它们与肿瘤临床特征的相关性,揭示了它们在胃癌进展中的作用;进一步采用甲基化特异性PCR方法,检测胃癌组织标本E-cadherin及S100A2基因启动子区甲基化情况,以揭示基因表达下降的机制及胃癌发病机制;采用RNAi技术,在E-cadherin和S100A2表达阳性的胃癌细胞系.MNK45细胞同时沉默E-cadherin和S100A2基因表达,观察干涉后的细胞效应,以研究E-cadherin和S100A2的功能及在胃癌发生中的作用机制。　　 材料及方法：　　 1、实验材料　　 ①组织标本:不同进展期胃癌组织标本64例,正常胃粘膜标本15例,均来自辽宁省肿瘤医院。　　 ②细胞株:MKN-45,来源于低分化腺癌,来自中国医科大学细胞生物教研室　　 ③质粒:pNeo-RNAi-E-cadherin siRNA,pNeo-RNAi-S100A2 siRNA表达载体由美国加州大学惠赠。　　 2、实验方法　　 ①半定量RT-PCR:Trizol试剂提取组织标本和细胞总RNA,反转录为cDNA,PCR扩增E-cadherin和S100A2特异性片段,以β-actin为内对照,进行半定量分析。　　 ②免疫组化:制备组织标本石蜡切片,用E-cadherin和S100A2特异性抗体进行杂交,统计分析蛋白和基因表达与临床特征间的相关性。　　 ③甲基化特异性PCR:酚氯仿提取胃癌组织标本DNA,亚硫酸盐修饰DNA后,纯化产物。用甲基化特异性引物进行PCR扩增,检测扩增结果并进行统计分析。　　 ④Western Blot:检测RNA干涉后MKN-45细胞中E-cadherin和S100A2蛋白表达情况。　　 ⑤MTT实验:检测RNA干涉后MKN-45细胞增殖情况。　　 ⑥Transwell实验:分析RNA干涉后细胞侵袭力的变化情况。　　 结果：　　 1、E-cadherin RT-PCR结果:正常对照胃黏膜组织E-cadherin基因表达阳性率为100％,不同进展期的胃癌组织基因表达的阳性率下降。E-cadherin在64例胃癌的表达量为1.245±0.153,而正常胃组织的E-cadherin表达量为2.105±0.216,差异有显著(P＜0.01)。　　 2、S100A2 RT-PCR结果:正常对照胃黏膜组织基因表达阳性率为100％,不同进展期胃癌组织基因表达的阳性率下降。S100A2在64例胃癌的表达量为1.877±0.224,而正常胃组织的S100A2表达量为2.387±0.293,差异有显著性(P＜0.01)。　　 3、E-cadherin免疫组化结果:E-cadherin主要表达在细胞膜,细胞浆中有少量表达。结果显示正常胃黏膜组织蛋白表达阳性率为100％,64例胃癌组织中蛋白表达阳性率下降为71.87％(46/64)。　　 4、S100A2免疫组化结果:阳性表达见于腺上皮细胞的胞浆和胞核。15例正常胃黏膜组织蛋白表达阳性率为100％,胃癌组织中蛋白表达阳性率为62.5％(40/64),明显低于正常胃黏膜组织。　　 5、E-cadherin的表达与胃癌临床病理特征的关系:E-cadherin在不同分化程度,不同浸润深度的胃癌中表达差异有显著性(P＜0.05);在有淋巴结转移与无淋巴结转移的病例组中,E-cadherin的表达量差异有显著性(P＜0.01),而在不同生长方式上表达差异无统计学意义。而E-cadherin蛋白在各种临床特征分组上表达差异均具有显著性(p＜0.01)　　 6、S100A2的表达与胃癌临床病理特征的关系:S100A2在不同分化程度,有淋巴结转移与无淋巴结转移的病例组中胃癌中表达差异有显著性(P＜0.01);在不同浸润深度的胃癌组织中表达差异具有统计学意义(p＜0.05),而S100A2的表达量在不同生长方式上差异无统计学意义(P＞0.05),而S100A2的表达在各临床特征分组上表达差异均具有显著(p＜0.01,P＜0.05)　　 7、E-cadherin基因启动子区甲基化特异性PCR扩增结果:64例胃癌组织标本甲基化比率为59.38％(38/64),正常胃粘膜组织甲基化比率为13.3％(2/15).　　 8、S100A2基因启动子区甲基化特异性PCR扩增结果:64例胃癌组织标本甲基化比率为56.25％(36/64),正常胃粘膜组织甲基化比率为13.3％(2/15)。　　 9、胃癌组织中E-cadherin基因启动子区甲基化与胃癌生物行为的关系:E-cadherin基因启动子区甲基化在高、中分化组,低、未分化胃癌组织中差异显著(p＜0.01)。淋巴转移阳性组、浸润深度浆膜外组甲基化程度高于相对应的阴性组及浆膜内组,差异显著(p＜0.01)。在生长方式特征上,两组无统计学差异。　　 10、胃癌组织中S100A2基因启动子区甲基化与胃癌生物行为的关系:S100A2基因启动子区甲基化在低、未分化,高、中分化组胃癌组织中差异显著(p＜0.05)。淋巴转移阳性组、浸润深度浆膜外组甲基化程度高于相对应的阴性组及浆膜内组,差异显著(p＜0.01,p＜0.05)。在生长方式特征上,两组无统计学差异。　　 11、siRNA对MKN45细胞E-cadherin和S100A2 mRNA表达明显抑制:RNAi第7天RT-PCR扩增结果与对照相比E-cadherin和S100A2 mRNA表达明显抑制。　　 12、siRNA对MKN45细胞E-cadherin和S100A2蛋白表达的影响:siRNA干涉第7天,实验组与对照组相比E-cadherin和S100A2蛋白表达无明显减弱;干涉第10天,实验组大约90％细胞蛋白表达减弱,表明E-cadherin和S100A2蛋白表达受到抑制。　　 13、E-cadherin和S100A2蛋白表达下调对细胞增殖的影响:MTT实验显示E-cadherin和S100A2表达抑制后细胞生长速度增加。将pNeo-RNAi-E-cadherin和pNeo-RNAi-S100A2重组载体转染MKN45细胞后,细胞生长率逐渐增加,第7天和10天增长率分别为12％和25％(P＜0.05)。　　 14、E-cadherin和S100A2蛋白表达下调对细胞侵袭力的影响:干涉第11天,E-cadherin和S100A2蛋白表达下调,细胞侵袭力明显增加。干涉前后都有细胞穿透滤膜,但干涉后细胞数明显高于干涉前,细胞数分别为49±5和68±8,两组有显著差异(P＜0.05)。　　 结论：　　 1、E-cadherin和S100A2在胃癌组织中表达均下降,是肿瘤抑制因子。　　 2、E-cadherin和S100A2的表达与胃癌的分化、转移、浸润呈负相关。　　 3、胃癌组织存在E-cadhefin和S100A2基因启动子区高甲基化状态。　　 4、E-cadherin和S100A2基因启动子区甲基化是导致基因表达下降的原因之一,甲基化状态与胃癌分化、转移、侵袭相关。　　 5、E-cadhedn和S100A2蛋白具有抑制细胞增殖和侵袭的功能,作为抑癌因子参与胃癌的发生与转移。