【摘 要】
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目的:探索构建能表达人B型利钠肽(hBNP)的pLenti6/V5-hBNP载体的方法,以实现hBNP基因在骨骼肌成肌细胞中长久、稳定的表达。方法:体外培养SD(Sprague Dawley)鼠骨骼肌成肌细
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目的:探索构建能表达人B型利钠肽(hBNP)的pLenti6/V5-hBNP载体的方法,以实现hBNP基因在骨骼肌成肌细胞中长久、稳定的表达。方法:体外培养SD(Sprague Dawley)鼠骨骼肌成肌细胞,并通过免疫组织化学方法鉴定所得细胞、用台酚兰染色确定培养细胞的活性并绘制生长曲线。将目的基因hBNP亚克隆到真核细胞表达载体pLenti6/V5-D-TOPO载体上,构建重组质粒pLenti6/V5-hBNP。将pLenti6/V5-hBNP及阳性对照质粒pLenti6/V5-EGFP分别用lipofectamin 2000介导转染293FT细胞,获得病毒颗粒;用病毒颗粒转染体外培养的SD乳鼠骨骼肌成肌细胞。荧光显微镜下计数确定阳性对照质粒的瞬时转染数,从而估计该基因的瞬时转染效率。加入筛选试剂以获得稳定表达异源B型利钠肽(BNP)的成肌细胞。收集瞬时转染及筛选后的细胞培养基,用酶连结免疫吸附分析(ELISA)检测试剂盒检测hBNP的表达水平。结果:聚合酶链式反应法、双酶切法及DNA测序显示hBNP基因成功地插入到pLenti6/V5-D-TOPO载体中;免疫组化显示此法培养成肌细胞质的纯度达到94 %,并且台酚兰染色细胞的存活率亦达到了94 %以上;阳性对照质粒的病毒颗粒感染细胞12 h后,在荧光显微镜下观察,其转染效率达60%以上。检测收集的上清,结果与阴性对照有显著差别(P<0.01),观察至第4 w,hBNP仍持续稳定表达。结论:本实验成功构建了能在真核细胞内表达人B型钠尿肽的重组质粒pLenti6/V5-hBNP,并且取得了较高的转染效率,因此慢病毒载体介导的基因治疗在心血管疾病中有乐观的应用前景。
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