论文部分内容阅读
目的:研究苯并[a]芘（B[a]P）对人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）能量代谢的影响,分析其与氧化损伤及细胞凋亡的关系,探讨B[a]P对神经细胞能量代谢的影响规律,为研究B[a]P神经毒作用机制提供依据。方法:细胞培养及染毒:以不同浓度B[a]P（0、0.1、1、10μmol/L）染毒SH-SY5Y细胞24h,观察B[a]P对SH-SY5Y细胞影响的剂量反应关系。选取0、1μmol/LB[a]P分别染毒细胞24h、48h、72h,观察B[a]P对SH-SY5Y细胞影响的时效关系。以终浓度1μmol/L B[a]P分别染毒细胞24h、48h、72h后均换为正常培养基继续培养24h,观察B[a]P对SH-SY5Y细胞损伤是否具有可恢复性。1μmol/L B[a]P+20μmol/L丁基羟基茴香醚（BHA）共同处理细胞24h、48h、72h,观察B[a]P对SH-SY5Y细胞造成的损伤是否可恢复。细胞损伤指标检测方法:采用MTT法检测细胞活力;细胞丙二醛（MDA）测定试剂盒测定细胞内MDA含量;超氧化物歧化酶（SOD）分型测试盒测定细胞内T-SOD、CuZn-SOD及Mn-SOD活力;活性氧检测试剂盒测定细胞内ROS水平;线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）测定细胞线粒体膜电位（Δψm）;Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒测定细胞凋亡水平。能量代谢指标检测方法:Seahorse XFp细胞能量分析仪检测细胞耗氧率（OCR）及胞外酸化率（ECAR）,OCR反映细胞线粒体呼吸能力,ECAR反映细胞糖酵解能力。结果:细胞损伤检测结果显示:随着染毒剂量的增加,细胞活力、Mn-SOD活力、Δψm呈下降趋势(P趋势<0.01),细胞内ROS水平、MDA含量、早期凋亡率呈上升趋势(P趋势<0.01),T-SOD及CuZn-SOD活力低剂量升高,中高剂量下降。其中1、10μmol/L组细胞活力与对照组相比显著降低（P<0.05）;1、10μmol/L组细胞内MDA含量与对照组相比显著升高（P<0.05）;0.1、1、10μmol/L组细胞内ROS水平、Mn-SOD、T-SOD、CuZn-SOD活力、Δψm及早期凋亡率与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05）。时效性实验显示:随着染毒时间的延长,T-SOD、CuZn-SOD及Mn-SOD活力、Δψm呈下降趋势(P趋势<0.01);细胞内ROS水平、MDA含量、早期凋亡率呈上升趋势(P趋势<0.01)。其中染毒48h、72h组与24h组相比,Mn-SOD活力、Δψm显著降低（P<0.05）;染毒48h、72h组与24h组相比,细胞内ROS水平、MDA含量、早期凋亡率显著升高（P<0.05）。恢复实验发现,24h组与恢复前相比,细胞活力、T-SOD、CuZn-SOD、Mn-SOD活力及Δψm显著升高（P<0.05）,ROS水平、MDA含量、早期凋亡率显著降低（P<0.05）。细胞能量代谢指标检测结果显示:随着B[a]P染毒剂量的增加,细胞的基础有氧呼吸、ATP偶联有氧呼吸速率、有氧呼吸最大值、糖酵解水平、糖酵解最大值及糖酵解储备值均呈下降趋势(P趋势<0.01),各剂量组基础有氧呼吸、ATP偶联有氧呼吸速率与对照组相比显著降低（P<0.05）;10μmo1/L组有氧呼吸最大值、有氧呼吸储备值、糖酵解水平、糖酵解最大值及糖酵解储备值与对照组相比显著降低（P<0.05）,质子渗漏耗氧率与对照组相比显著升高（P<0.05）。时效性实验显示:随着染毒时间的延长,细胞基础有氧呼吸、ATP偶联的有氧呼吸速率、有氧呼吸最大值、有氧呼吸储备值及糖酵解最大值均呈下降趋势(P趋势<0.01)。染毒48h组与24h组相比,ATP偶联的有氧呼吸速率、有氧呼吸最大值、有氧呼吸储备值及糖酵解最大值与对照组相比显著降低（P<0.05）;质子漏耗氧速率与对照组相比显著升高（P<0.05）。染毒72h组与24h组相比,基础有氧呼吸、ATP偶联的有氧呼吸速率、有氧呼吸最大值、有氧呼吸储备值、糖酵解水平及糖酵解储备值与对照组相比显著降低（P<0.05）。恢复实验发现,24h组与恢复前相比,ATP偶联的有氧呼吸速率显著升高（P<0.05）。抗氧剂BHA干预结果显示:加入BHA进行抗氧化干预,细胞基础有氧呼吸、ATP偶联的有氧呼吸速率、有氧呼吸最大值、有氧呼吸储备值及糖酵解水平均显著升高（P<0.05）;细胞内ROS水平、MDA含量、早期凋亡率及晚期凋亡率显著降低（P<0.05）,T-SOD、CuZn-SOD、Mn-SOD活力及Δψm显著升高（P<0.05）。细胞损伤与能量代谢各参数相关分析结果显示:MDA含量、ROS水平与能量代谢各参数均呈负相关;T-SOD活力与基础有氧呼吸、ATP偶联的有氧呼吸速率、有氧呼吸最大值、有氧呼吸储备值、糖酵解水平、糖酵解最大值、糖酵解储备值呈正相关;CuZn-SOD活力与有氧呼吸储备值、糖酵解储备值呈正相关,Mn-SOD活力与基础有氧呼吸、ATP偶联的有氧呼吸速率、有氧呼吸最大值、有氧呼吸储备值、糖酵解水平、糖酵解最大值呈正相关。Δψm、早期凋亡率、晚期凋亡率与能量代谢各参数均呈负相关。结论:B[a]P引起线粒体呼吸功能损伤,且效应具有剂量及时间依赖性,低剂量及短时间暴露具有一定可恢复性,高剂量可引起有氧呼吸储备能力及糖酵解功能的降低。同时,B[a]P可引起细胞氧化损伤、抗氧化能力降低及细胞凋亡,且效应具有剂量及时间依赖性,低剂量及短时间暴露细胞损伤具有一定可恢复性。B[a]P可引起细胞能量代谢紊乱,氧化损伤可能是其主要原因,而能量代谢紊乱最终引起细胞凋亡。