研究背景糖尿病(diabetes mellitus,DM)是严重影响人类健康的慢性非传染性疾病,随着饮食结构和生活方式的改变,其患病率、发病率和患者数量急剧上升,给家庭及社会带来沉重的经济负担。糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病微血管病变的主要并发症之一,即使血压及血糖控制达标,糖尿病患者最终有30%—40%发展至糖尿病肾病。在全球范围内,糖尿病肾病是引起终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)的主要原因。既往认为糖尿病肾病在进展过程中,最重要的病理生理变化为不可逆的肾小球纤维化及瘢痕形成,肾小管损伤只是继发现象。但随着研究的深入人们发现,肾小管病变,尤其是肾小管间质的纤维化(tubulointerstitial fibrosis, TIF)在推动糖尿病肾病进展中起了非常重要的作用,肾小管病变可不依赖于肾小球的病变。因此,探讨延缓肾小管间质纤维化的治疗策略,对于改善患者预后具有十分重要的意义。尽管TIF的发病机理尚未明了,但越来越多的证据指向肾小管上皮细胞凋亡及肾小管上皮细胞-成纤维细胞(间充质细胞)转分化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)。EMT是糖尿病肾脏疾病小管损伤的经典病理改变,且与肾间质纤维化的程度相平行。越来越多的研究强有力地证实了EMT在不同类型的肾脏疾病中发挥着重要作用,而逆转EMT则能有效改善肾脏纤维化。虽然大量研究揭示了各种EMT的始动因素、调节因子及存在的信号通路,但在所有因素中,TGF-β1是多种组织和器官纤维化的关键调控因子,是糖尿病肾病进展过程中的主要炎性因子,其启动并调节EMT的全过程,其主要通过①诱导细胞凋亡导致细胞丢失②直接作用于成纤维细胞、系膜细胞等上调细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成,抑制ECM降解③促进肾小管上皮细胞EMT参与肾脏纤维化过程。已有研究表明,TGF-β1可诱导肾小管上皮细胞呈现肌成纤维细胞的形态,即极性改变、出现肌动蛋白微丝及致密小体,且胶原蛋白产生增加。尽管TGF-β1可通过RhoA,ERK,P38-MAPK, JNK和Wnt/β-catenin途径介导上述改变,但目前TGF-β/Smad被认为是介导这一过程最主要的信号通路。活化的TGF-β1使得Smad2和Smad3磷酸化,随后,磷酸化的Smad2和Smad3同Smad4结合后形成Smad低聚复合物,并转入细胞核调节靶基因转录。糖尿病时,许多促炎因子能激活Smad信号通路,在糖尿病肾病患者肾小球及间质纤维化区域可见到磷酸化的Smad2及Smad3沉积,证明有TGF-β/Smad信号通路的活化。目前临床上尚无治疗糖尿病肾病的特效药物,只能通过控制饮食、降糖、降压等措施进行治疗,效果有限。中医药治疗历史悠久,中药因其多成分、治疗多靶点的特点,具有良好的应用前景。黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根,具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌的功效。黄芪甲苷(AstragalosideⅣ,ASI)是黄芪皂苷的单体成分,具有抗氧化、减轻缺血再灌注损伤等作用,在防治急性肾损伤、膜性肾病、糖尿病肾病等肾脏疾病中发挥重要作用。目前,对ASI防治糖尿病肾病的报道大多局限于足细胞及系膜细胞,对肾小管间质纤维化研究较少,因此本研究拟通过体内及体外实验探讨ASI抑制糖尿病肾病肾间质纤维化的作用和机制。研究目的观察ASI对2型糖尿病模型KKAy小鼠肾组织TGF-β/Smad信号通路及其对高糖诱导下肾小管上皮细胞NRK-52E的影响,探讨ASI对肾间质纤维化的保护作用及机制,为临床应用ASI提供实验依据。研究方法1.动物分组:购入小鼠适应性喂养2周,KKAy小鼠予以KK饲料(高脂)喂养至14周,随机血糖超过13.9mmol/L提示造模成功;血糖水平相近的KKAy小鼠随机分为模型组(10只)和ASI组(10只),正常饮食的同龄10只雄性C57BL/6J小鼠作为对照组。其中对照组和模型组每日予以生理盐水予以40mg/kg灌胃,ASI组予以ASI 40mg/kg灌胃;2.血糖、血肌酐、尿ACR检测:每周测量小鼠体重,于第16周、20周、24周采取提尾反射法收集随机尿液,ELISA试剂盒检测尿微量白蛋白和尿肌酐,计算尿ACR,尾静脉取血测血糖,内眦取血测血肌酐;3. 24周时断颈处死小鼠,分离肾脏,行HE染色、Masson染色观察各组肾脏病理变化;4.应用免疫组化染色检测各组肾脏TGF-β1、Smad2/3、α-SMA的表达;5. ASI对NRK-52E细胞活力的影响:NRK-52E细胞生长至融合状态时,同步化培养24小时,以不同浓度的ASI (0、10、20、40、80、100μg/ml,依次简写为 0、ASI10、ASI20、ASI40、ASI80、ASI100)刺激 NRK-52E 细胞 24小时,细胞计数试剂盒CCK-8检测细胞活性;6. ASI对高糖诱导下NRK-52E细胞凋亡的影响:①细胞长至融合状态时,同步化培养24小时,设正常对照组、高糖组、ASI各组:高糖DMEM中加入ASI,浓度分别为 20、40、80、100μg/ml (依次简写为 HG+ASI20、HG+ASI40、HG+ASI 80、HG+ASI 100),分别刺激NRK-52E细胞24小时,或②用高糖+ASI 100μg/ml 分别刺激细胞 0、4、8、12、24、48 小时,用 AnnexinV-FITCPI 试剂盒检测细胞凋亡;7. ASI 对高糖诱导的NRK-52E 细胞 Smad2、Smad3、α-SMA、TGF-β1 表达的影响:细胞生长至融合状态时,同步化培养24小时,设正常对照组、高糖组、ASI各组(同前述),分别刺激NRK-52E细胞24小时,以Real-Time PCR检测 Smad2、Smad3、α-SMA、TGF-β1 核酸水平的表达,Western Blot 检测 Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、α-SMA、TGF-β1 蛋白水平的表达;8.统计学方法:计量资料以均数±标准误表示,根据方差齐性检验结果,两组间比较采用独立样本t检验,多组比较采用单因素方差分析,所有数据均由统计软件SPSS 19.0完成,以P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为差异有显著统计学意义。研究结果1. 一般状态:对照组小鼠精神状态好,反应灵敏,毛色顺滑;模型组小鼠精神萎靡不振,步履迟缓,烦渴多尿,反应迟钝,毛发无光泽,且随着周龄的增加,上述症状更加明显。ASI组小鼠的状态介于上述两组之间。在16、20、24周龄时,模型组及ASI组小鼠体重均比同龄对照组小鼠大(均P<0.01);与模型组小鼠相比,ASI组体重增长减缓(均P<0.05);2.血糖、血肌酐、尿ACR检测:在各观察时间点,与同龄对照组相比,模型组及ASI组血糖、尿ACR明显升高(均P<0.01);与同龄模型组相比,ASI组血糖、尿ACR较低(P<0.05, P<0.01)。三组小鼠血清肌酐检测结果无统计学差异(P>0.05);3.各组小鼠肾组织病理改变:光镜下可观察到对照组肾小球及肾小管结构清晰,系膜细胞数量正常,间质中未见炎细胞浸润及纤维化;模型组肾小球肥大,系膜基质增宽,系膜细胞增多,肾小管上皮细胞胞浆出现空泡、肾小管腔可见透明管型,肾间质炎症细胞增多,充血水肿;ASI组肾小球及系膜区改变介入对照组及模型组之间,肾小管上皮细胞轻度肿胀,胞浆较少,未间明显的间质纤维化;4.免疫组化染色检测各组肾脏TGF-β1、Smad2/3及α-SMA的表达情况:α-SMA、TGF-β1及Smad2/3主要在肾小管-间质表达;对照组少见TGF-β1表达,而模型组及ASI组TGF-β1表达增强(P<0.01,P<0.05),与模型组相比,ASI组TGF-β1表达减弱(P<0.01);对照组α-SMA多数表达于肾血管平滑肌,在肾小管间质偶有表达,但在模型组可见α-SMA在肾小管上皮细胞、肾小管周围均有所表达(P<0.01),与模型组相比,ASI组α-SMA表达明显下调(P<0.01);对照组肾小管与肾小球细胞核有少量Smad2/3表达,模型组及ASI组表达增加(P<0.01,P<0.05),但同模型组比较,ASI组Smad2/3表达减少(P<0.01);5. ASI对NRK-52E细胞活力的影响:不同浓度ASI分别作用于NRK-52E细胞24小时,各组之间细胞活性差异无统计学意义(P>0.05);6. ASI对高糖诱导下NRK-52E细胞凋亡的影响:与对照组相比,高糖组细胞凋亡增加(P<0.01),加入 ASI 后,HG+ASI 40、HG+ASI 80、HG+ASI 100组的细胞凋亡均较高糖组减轻(均P<0.05 ): HG+ASI 100μg/ml作用于细胞8h后,细胞凋亡显著受抑,且随着时间的延长,此作用有逐渐增强的趋势(与Oh相比,均P<0.05);7. ASI 对高糖诱导的 NRK-52E 细胞 Smad2、Smad3、α-SMA、TGF-β1 mRNA的影响:与对照组相比,高糖组(HG)、HG+ASI20组Smad2、TGF-β1mRNA表达上调(均P<0.01),Smad3表达上调(均P<0.05) , HG、HG+ASI20、HG+ ASI 40 α-SMA 表达上调(均P<0.01);与 HG 相比,HG+ASI 80、HG+ASI 100 组 α-SMA、Smad3 mRNA 表达下调(均P<0.05),HG+ASI 40、HG+ASI 80、HG+ASI 100 TGF-β1 表达下调(均P<0.01),HG+ASI 20、HG+ASI 40、HG+ASI 80、HG+ASI100Smad2 表达下调(P<0.05);8. ASI 对高糖诱导的 NRK-52E 细胞 Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、α-SMA、TGF-β1蛋白水平的影响:与对照组相比,高糖组(HG)、HG+ASI20、HG+ASI40组α-SMA、Smad2、Smad3表达上调,差异有统计学意义(均P<0.01),p-Smad2、p-Smad3 在 HG、HG+ASI20、HG+ASI40、HG+ASI80 组表达均上调(均P<0.01 ),TGF-β1在HG、HG+ ASI 20组表达上调(均P<0.01);与 HG 相比,HG+ASI80、HG+ASI 100 组 α-SMA、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3表达下调,差异有统计学意义(均P<0.05),TGF-β1在HG+ASI40、HG+ASI80、HG+ASI100 组表达下调(均P<0.05)。研究结论1.黄芪甲苷可减轻糖尿病KKAy小鼠的高血糖、肥胖及尿ACR,但不影响血肌酐;2.黄芪甲苷可改善糖尿病KKAy小鼠的肾小管间质纤维化,其作用机制可能与ASI下调TGF-β/Smad信号通路有关;3.黄芪甲苷可呈剂量及时间依赖性抑制高糖诱导的NRK-52E细胞凋亡;4.黄芪甲苷可抑制高糖诱导的NRK-52E细胞α-SMA表达及TGF-β1/Smad信号通路活性,从而减轻EMT,延缓肾间质纤维化。