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研究背景及目的: 急性脑缺血后会引发一系列的损伤级联反应，包括钙稳态失衡、兴奋性氨基酸的毒性作用、氧化应激损伤、线粒体功能障碍等，以及随之产生的蛋白酶激活、基因表达的改变，最终导致细胞坏死或凋亡。大量研究表明，氧化应激损伤在脑缺血后神经元损伤中起到了关键作用。氧化应激时自由基的大量生成导致细胞内Ca2+超载，细胞内Ca2+浓度的增加能激活凋亡，使细胞产生不可逆的细胞的损伤。氧化应激时可激活自噬溶酶体途径，细胞内自噬体的数量增加。自噬体吞噬细胞内受损的线粒体和内质网，并能控制线粒体的数量和质量。对抗细胞内的钙超载，有细胞保护作用。但是缺血再灌注时高尔基体钙泵SPCA1对细胞内钙超载的应答、自噬对SPCA1的功能影响方面的研究鲜有人涉及。本实验将从神经元受到缺血再灌注损伤时自噬的是否激活、激活的自噬对高尔基体的SPCA1的影响方面探讨自噬对高尔基体的影响。寻求减少氧化应激损伤的新途径。 方法: 1.建立氧化应激模型:选择不同浓度的H2O2作用于N2a细胞，以MTT法检测不同浓度的H2O2对N2a细胞活性的影响; 2.实验分为正常组H2O2处理组和3-MA预处理组;H2O2处理组和3-MA预处理组H2O2的浓度分别为20μM、50μM、80μM; 3.H2O2处理后MDC染色检测自噬的活性变化; 4.Fura-2/am检测各组细胞内Ca2+浓度的变化; 5.RT-PCR检测各组SPCA1mRNA表达变化; 6.Western blot检测3-MA预处理前后，模型高尔基体蛋白SPCA1及自噬标记物LC3B表达变化。 实验结果: 1.MTT结果显示随着Ca2+浓度的增加，细胞损伤逐渐加重，H2O2对细胞的损害具有浓度依赖性，MDC染色观察自噬数目发现，自噬颗粒也随着H2O2浓度的增加而增加。LC3B的western blot结果也表明自噬活性随H2O2浓度的增加而增加(P＜0.05)，同时证明自噬抑制剂3-MA可有效抑制自噬活性。 2.细胞经H2O2处理后，Fura-2/am检测到细胞内Ca2+浓度较正常组明显增加(P＜0.05)，除20μM浓度时H2O2处理组和3-MA预处理组的细胞内Ca2+浓度变化不明显外(P＞0.05)，其余各组3-MA预处理组均较H2O2处理组的细胞内Ca2+浓度较H2O2组增加更显著(P＜0.05)。 3.与正常组比较，H2O2处理组SPCA1mRNA和SPCA1蛋白表达明显较少(P＜0.05)，3-MA预处理组SPCA1mRNA和SPCA1蛋白表达较H2O2组表达更少(P＜0.05)，但是20μM浓度的H2O2时，两组之间SPCA1变化不明显(P＞0.05)。 结论: 1.自噬溶酶体途径在遭受氧化应激损伤时可被激活; 2.氧化应激可诱导自噬水平表达上调; 3.阻断自噬溶酶体途径可使细胞SPCA1表达减少，作用减弱，加重细胞内钙超载。