毒蕈碱型乙酰胆碱受体(AChR)是G蛋白偶联受体(GPCR)的成员之一。分子生物学分型依据M受体克隆基因序列差异，分为而M1-M5五种亚型，分子量约51-66kD，由460-590个氨基酸残基组成，由细胞外的N端七次跨过细胞膜至胞浆内的C端，形成三个膜外环(01-02)和三个膜内环(i1-i3)，其中N末端、C末端和i3环在不同亚型间的变异最大，且以i3环最为显著，它在胞浆内形成一个157-240个氨基酸的柱状a螺旋结构，目前普遍认为i3环是M受体不同亚型发挥作用的关键部位。M受体广泛分布于中枢及外周神经系统的神经组织、心肌、平滑肌和各种腺体，与相应配体结合可与G蛋白偶联引起细胞内的一系列信号传递及生物化学反应，影响细胞的活动或功能，参与调节各种生理反应，同时还参与某些疾病的发生。 G蛋白(G protein)作为一种十分重要的信号分子，近年进展迅速，其分子量约为100kD，由α(39-46kD)、β(36kD)和γ(7-8kD)三种亚基构成。其中，α亚基差别最大，是功能亚基，每种G蛋白的α亚基都有独特的氨基酸序列和结构，但都有一定的同源性。依据α亚基的不同将G蛋白分为Gs、Gi、Gq、G12/13四种类型。在G蛋白介导的跨膜信号中，GPCRs，G蛋白和效应蛋白是信号转导通路中的三个基本成分，它们的结构、功能及其在信号转导中的作用正在被逐渐揭示。 分子生物学上将M受体分成两组：其中M1受体、M3受体和M5受体归为M1组，主要通过Gq/11作用于磷脂酰肌醇系统激活磷脂酶C(PLC)，生成1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)和二酯酰甘油(DAG)；而M2受体和M4受体则归为M2组，通过与Gi/G0偶联抑制腺苷酸环化酶(AC)，使环磷酸腺苷(cAMP)生成减少。 本研究采用分子生物学技术，可将M2AChR与G蛋白Gila亚单位的cDNAs进行重组，通过杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中表达M2-Gila融合蛋白，利用放射配体结合实验检测这种高效偶联的融合蛋白的偶联功能，可阐明M2AChR与G蛋白Gila亚单位相互作用和信号转导机制及影响因素，鉴别和寻找M2受体亚型特异性药物。 材料与方法: 1、材料 人M2AChR与牛Gila的cDNAs(PEF-hm2，pGa28)，杆状病毒载体质粒pBacPAK9的cDNAs，乙酰胆碱(ACh)，阿托品(atropine)，氧化震颤素(oxotremorine)，槟榔碱(arecoline)、fangchinoline、levitimide及鸟苷5’-O-(3-硫代三磷酸)[guanosine-5’-O-(3-thiotriphosphate)，GTPγS]等均由日本东京大学医学部脑研生化教研室芳贺教授惠赠；Sf9昆虫细胞株受赠于北京大学生命科学院陈建国教授；TNM-FH昆虫细胞培养基购于Sigma公司；胎牛血清购于TBD公司；[3H]QNB(L-quinuclidinyl benzilate，1.8PBq/mol)、[35S]GTPγS(guanosine-5-O-(3-thiotriphosphate，40PBq/mol)购于Amersham Pharmacia Biotech公司。 2、方法 通过PCR的方法分别扩增M2AChR与Gila的cDNAs，纯化后经第二次PCR进行连接，再次切胶、纯化，酶切消化后连接到病毒载体中，转染Sf9细胞，培养48小时后收获细胞，提取病毒和细胞沉淀。从细胞沉淀中经消化、研磨、离心方法提取M2AChR-Gila融合膜蛋白，-70℃冻存备用。融合蛋白经BCA方法初测含量后，进行[3H]QNB和[35S]GTPγS结合实验检测M2-Gila融合蛋白的功能并筛选M2受体的特异性配体。 结果: M2AChR与Gila的cDNAs分别扩增连接后插入到病毒载体中，并在Sf9细胞中成功表达。接种病毒后的Sf9细胞，细胞肿胀变大，大小不均，细胞内颗粒增多，继续培养48小时后收获细胞，提取病毒和细胞沉淀。从细胞沉淀中经消化、研磨、离心方法提取膜蛋白，BCA方法测定膜蛋白含量为1.68mg/ml，[3H]QNB放射配体饱和实验结果，M2-G11α融合蛋白与[3H]]QNB特异性的、高水平的结合位点，随着[3H]QNB浓度的升高，融合蛋白与[3H]QNB的结合量增加，具有M受体的特性，可用于检测M2与Gi1α相互作用和信号转导机制及影响因素的研究。[35S]GTPγS结合实验检测，乙酰胆碱(ACh)、氧化震颤素(oxotremorine)、槟榔碱(arecoline)为M2受体的激动剂，阿托品(atropine)、fangchinoline、levitimide为M2受体的拮抗剂。 讨论: 分子生物学方法的广泛应用，为研究M受体亚型及信号转导提供了新的途径。本研究以高效偶联的M2AChR-G11α融合蛋白为研究对象，检测在配体作用下，M2AChR-G11α融合蛋白的表达和功能的变化，探讨信号转导中分子间相互作用的机制和影响因素，筛选M2受体亚型特异性药物。 配体调节的GTPγS与G蛋白的结合是研究M受体与G蛋白偶联的敏感方法。在GDP替代[35S]GTPγS结合实验中，在不同M受体配体、不同浓度GDP存在时，[35S]GTPγS竞争性结合作用的变化表明不同配体可以引起替代结合曲线偏移的方向和幅度不同，这种偏移代表了M2-G11α融合蛋白中的Gi1α与GDP亲和力的大小，GDP与Gi1α的亲和力越低，M2催化GDP由Ga上解离下来的能力越低，即激动剂作用时亲和力减小，拮抗剂则使亲和力增强。当与完全激动剂结合时，M2-Gi1α融合蛋白与GDP的亲和力最低，与部分激动剂结合时次之，与拮抗剂结合时最强。因此，通过分析GDP与M2-G11α融合蛋白亲和力的大小可以筛选和鉴定M2受体未知的特异性完全激动剂、部分激动剂和拮抗剂。 M2-G11α融合蛋白成功表达为研究M2真受体后信号转导机制提供了便利条件，同时也为筛选M2受体亚型特异性配体提供了可能性，为M2受体亚型特异性新药开发和研制提供了有力的实验手段。 结论: 杆状病毒—Sf9细胞系统表达的M2-G11a融合蛋白具有与配体结合的特性及组分间偶联的能力，配体通过改变M2-G11a融合蛋白中G11a与GDP的亲和力活化融合蛋白，这一特性可用于筛选受体特异性的激动剂和拮抗剂。乙酰胆碱(ACh)、氧化震颤素(oxotremorine)、槟榔碱(arecoline)为M2受体的激动剂，阿托品(atropine)、fangchinoline、levitimide为M2受体的拮抗剂。