背景原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁人类的健康,临床上比较多见的是肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)。肝癌的发病率在所有恶性肿瘤中排名第5位；在肿瘤相关的死亡率中排名第3位,仅次于肺癌和胃癌；每年全球大约有100万人死于肝癌。在我国,肝癌的发病人数占全世界的43.7%,每年新发的肝癌患者约36万,每年的死亡人数超过30万。肝癌在我国恶性肿瘤发病率中排第3位,在癌症相关死亡率高居第2位。HCC缺乏特异性的症状和体征。据统计,目前不到一半的患者能够得到早期诊断,大部分的患者诊断时已是中晚期,失去了手术机会。目前,诊断HCC最主要的血清学检查是甲胎蛋白(α-fetoprotein, AFP)。但是,AFP诊断HCC的敏感度和特异度都不是很高。部分慢性肝炎和肝硬化患者血清AFP水平也会升高；AFP在HCC诊断中存在一定的误诊率和漏诊率。虽然近年来有报道显示甲胎蛋白异质体、高尔基蛋白73等新的血清标志物可用于诊断HCC,但是由于特异性或成本等问题,未能在普查中广泛应用。因此目前还需要寻找高敏感度和特异度、低成本的肿瘤标志物,可以用于HCC普查,提高HCC的早期诊断。目前,临床上HCC的治疗方法较多,包括外科手术、放疗、化疗、介入治疗、靶向治疗等,但是外科手术仍然是目前治疗HCC的最佳方法。然而,由于外科切除后的高复发率使得HCC患者的长期生存率仍然很低。因此,寻找能够预测HCC复发转移和患者生存率的标志物非常重要。这些标志物不仅有助于预测患者的预后,而且也可为术后辅助治疗提供参考指标,用来选择高危的患者进行辅助治疗,有利于延长HCC患者的生存时间,从而改善HCC的预后。但是,目前尚没有一个能够完全反应肿瘤预后的指标；难以在肿瘤发生复发转移前做出准确的预测。目前临床上最常用的判断预后的指标是肿瘤的病理学分期,但是其准确性仍无法令人信服。经常可见病理分期相同的患者拥有不同的预后,特别是早期的患者。因此,大家仍然在寻找可用来准确判断肝癌预后的指标。趋化因子20(Chemokine ligand20, CCL20),最初被称为肝脏激活调节趋化因子(Liver-and activation-regulated chemokine, LARC)或巨噬细胞炎症蛋白-3α(Macrophage inflammatory protein-3α, MIP-3α),是趋化因子CC家族中的重要一员。其唯一的受体是趋化因子受体6(Chemokine receptor6, CCR6)。CCL20主要在肝脏、肺脏、阑尾、扁桃体等器官表达,其中肝脏表达的CCL20水平最高。在炎症性疾病中,CCL20的主要功能是趋化未成熟的树突状细胞、效应T淋巴细胞和B淋巴细胞到炎症部位。最近的研究表明,CCL20在许多恶性肿瘤的发展中发挥重要作用,如口腔鳞状细胞癌、结直肠癌、胰腺癌、鼻咽癌、子宫内膜癌、前列腺癌等。研究显示HCC患者血清CCL20水平比肝硬化患者、慢性肝炎患者和正常健康人升高。同时,CCL20在HCC组织内的表达水平明显高于癌旁组织和正常肝组织,CCL20可能参与HCC的发生和发展。体外实验也证实HCC细胞株高表达CCL20。CCL20在体外能够促进HCC细胞系的生长。同时,CCL20能促进高表达CCR6的HepG2细胞伪足显著增多,表明CCL20可增强HCC细胞的侵袭和转移能力。以上资料表明,CCL20可能在HCC的发生发展中发挥重要作用；但是,目前CCL20对HCC的诊断价值和预后价值还不清楚。本研究拟通过酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测不同人群血清中CCL20的水平,研究血清CCL20与HCC临床病理特征的关系,同时评估血清CCL20对HCC的诊断意义；通过免疫组织化学法测定CCL20在HCC组织和癌旁组织内的表达水平,研究其与临床病理特征、外科切除术后早期复发转移和患者生存率的关系。通过该研究拟为HCC患者的诊断提供新的血清标志物,为HCC预后评估提供新的指标,为术后辅助治疗对象的选择提供理论依据。第一部分血清CCL20对肝癌的诊断价值目的1.比较不同人群血清中CCL20和AFP的水平,研究二者的相关性,了解HCC患者手术后CCL20的变化情况；2.研究CCL20与HCC临床病理特征的关系；3.评估CCL20对HCC的诊断价值。方法：1.我们收集从2011年9月到2012年1月来齐鲁医院就诊的78例HCC患者、25例肝硬化患者、24例肝炎患者和33例健康查体者的空腹血液样本。血清CCL20水平通过ELISA检测,血清AFP通过电化学发光免疫法检测。应用Kruskal-WalisH检验和Mann-Whitney U检验比较各组间CCL20和AFP的差异,应用Spearman相关分析研究四个组的CCL20与AFP之间的相关性。检测HCC患者术后第1、3、5、7和14天血清CCL20水平,了解HCC患者手术后的CCL20变化趋势。2.收集HCC患者的临床资料,用Kruskal-Walis H检验或Mann-Whitney U检验研究CCL20与HCC临床病理特征的关系。3.应用受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristics, ROC)曲线分析CCL20、AFP和CCL20联合AFP诊断HCC的能力,根据约登指数确定最佳截断值,应用Z检验比较CCL20、AFP和CCL20联合AFP对HCC的诊断价值。结果1.四组之间血清CCL20和AFP差异显著(P<0.001)。HCC患者中CCL20和AFP水平明显高于肝硬化患者、慢性肝炎患者和正常健康人(P均<0.050)。肝硬化患者和慢性肝炎患者的CCL20和AFP明显高于正常健康人(P均<0.050)。肝硬化患者的CCL20和AFP水平与慢性肝炎患者无明显差异(P>0.050)。HCC患者和肝硬化患者的血清CCL20水平与AFP水平相关(P分别=0.005和0.007)。慢性肝炎患者和正常健康人的CCL20与AFP无关(P分别=0.519和0.304)。HCC患者术后第1周CCL20下降明显,后下降缓慢,2周时仍高于正常健康人水平(19.3pg/ml vs13.6pg/ml, P=0.040)。2.大肝癌患者血清CCL20明显高于小肝癌患者(127.8pg/ml vs89.50pg/ml, P=0.007)。肿瘤侵犯血管的患者CCL20高于无血管侵犯的患者(134.3pg/ml vs85.70pg/ml,P=0.005)。肿瘤无包膜的患者CCL20水平明显高于肿瘤有包膜的患者(133.4pg/ml vs71.95pg/ml, P<0.001)。肿瘤低分化的患者CCL20水平高于肿瘤分化程度高的患者(128.4pg/ml vs85.30pg/ml,P=0.029)。3.CCL20所对应ROC曲线下面积为0.892,其最佳截断值为63.50pg/ml,该截断值的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确率分别为82.1%、87.8%、86.5%、83.7%和85.0%。AFP所对应ROC曲线下面积为0.793；其最佳截断值为108.1ng/ml,该截断值的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确率分别为82.1%、63.4%、68.1%、78.8%和64.4%。CCL20对HCC的诊断价值明显高于AFP (0.892vs0.793, P=0.021)。CCL20联合AFP所对应的ROC曲线下面积为0.895；与单纯CCL20的ROC曲线下面积相比较,差异无统计学意义(0.895vs0.892,P=0.933)。结论1.HCC患者血清中CCL20显著升高,并与AFP水平相关,手术2周内明显下降；CCL20可能与肿瘤的发生有关。2.血清CCL20与肿瘤的大小、血管侵犯、包膜和分化程相关；CCL20可能与肿瘤生物学行为相关,可能参与肿瘤的发生发展。3.CCL20对HCC的诊断价值高于AFP,可用于诊断HCC。第二部分肝癌组织和癌旁组织内CCL20表达与肝癌预后的关系目的1.比较CCL20在肝癌组织和癌旁组织内的表达；2.研究肝癌组织和癌旁组织内CCL20与临床病理特征的关系；3.分析肝癌组织和癌旁组织内CCL20与根治性切除术后患者生存率关系；4.分析肝癌组织和癌旁组织内CCL20与术后早期复发转移的关系。方法1.连续选择2005年1月到2006年8月齐鲁医院125例HCC患者的组织标本,采用免疫组织化学染色法检测CCL20在癌组织和癌旁组织的表达,并用Mann-Whitney U检验比较二者的差异。2.查阅患者的临床病理资料,用卡方检验分析癌组织和癌旁组织内CCL20水平与临床病理特征的关系。3.收集患者的随访结果,采用Kaplan-Meier方法计算患者的无瘤生存率和总体生存率,应用log-rank检验进行单因素分析；再应用Cox比例风险模型进行多分因素分析,找出术后无瘤生存率和总体生存率的独立影响因素；最后应用ROC曲线确定这些独立影响因素对术后复发转移和生存情况的预测价值。4.根据文献定义术后2年内的复发转移为早期复发转移,采用卡方检验进行早期复发转移的单因素分析；再应用逻辑回归模型进行多分因素分析,找出术后早期复发转移的独立影响因素；最后应用ROC曲线确定这些独立影响因素对术后早期复发转移的预测价值。结果1.无论是癌组织还是癌旁组织,CCL20都主要在细胞浆内表达,细胞膜和细胞核多无表达。CCL20在癌组织内的表达水平明显高于癌旁组织(P<0.001)。2.癌组织内CCL20表达水平与HCC的大小(P=0.002)、数目(P=0.031)、血管侵犯(P=0.003)和分化程度相关(P=0.024)。癌旁CCL20与肿瘤包膜(P=0.014)和血管侵犯有关(P=0.041)。3.单因素分析表明：癌组织内CCL20低表达组的无瘤生存率(61.9%vs21.0%,P<0.001)和总体生存率(71.4%vs37.1%,P<0.001)明显高于癌组织内CCL20高表达组。多因素分析表明：癌组织内CCL20水平是术后无瘤生存率和总体生存率的独立影响因素(Hazard ratio2.573, P=0.001和Hazard ratio2.930, P=0.001)。ROC曲线分析表明癌组织内CCL20可用于预测术后肿瘤复发转移(ROC曲线下面积为0.711)。癌旁组织内CCL20水平与HCC术后的无瘤生存率(P=0.225)和总体生存率(P=0.574)无关。4.单因素分析表明：癌组织内CCL20低表达组的术后早期复发转移率低于癌组织内CCL20高表达组(9.52%vs48.4%,P<0.001)。多因素分析表明：癌组织内CCL20是术后早期复发转移的独立影响因素(Hazard ratio8.760, P<0.001)。ROC曲线分析表明癌组织内CCL20可用于预测术后肿瘤早期复发转移(ROC曲线下面积为0.737)。癌旁组织内CCL20水平与术后早期复发转移无关(P=0.062)。结论1.CCL20主要在细胞浆内表达,CCL20在癌组织内表达增强,可能与肿瘤的生物学行为有关,可能参与HCC的发生发展。2.癌组织内CCL20与术后的无瘤生存率、总体生存率和早期复发转移有关,是HCC的独立预后因素；可以用来预测术后早期复发转移,为术后辅助治疗对象的选择提供依据。