第一部分ZDHHC8在难治性颞叶癫痫患者及动物模型中的表达实验目的:检测ZDHHC8在难治性癫痫患者及皮罗卡品慢性癫痫小鼠模型脑组织中的表达情况。实验方法:1.从课題组已经建立的约400例难治性TLE患者术后脑组织库中随机抽取16例TLE脑组织标本作为实验组,16例非癫痫患者(脑外伤,性别年龄无明显差异)脑组织(颞叶皮质)标本作为对照组。2.选取成年雄性C57BL/6小鼠(体重20-30 g,10-14周龄),通过腹腔注射匹罗卡品诱导癫痫持续状态(SE),待出现反复自发性发作(SRSs)后为慢性癫痫模型造模成功。选择有反复自发性发作小鼠为癫痫组(n=6),及没有反复自发性发作及未点燃的小鼠为癫痫对照组(n=6)。3.用免疫印迹方法检测ZDHHC8在TLE患者(颞叶皮质)和有自发性发作小鼠脑组织(颞叶皮质和海马)表达情况,免疫荧光检测ZDHHC8表达部位。实验结果:1.ZDHHC8在难治性TLE患者及非癫痫术后脑组织中均有表达,且ZDHHC8在癫痫患者术后脑组织中表达较对照组显著增高(**P<0.01)。2.匹罗卡品诱发的慢性癫痫小鼠模型中,ZDHHC8蛋白水平在有SRSs的小鼠皮质和海马表达均较无对照组明显增高(**P<0.01)。3.免疫荧光结果显示ZDHHC8在癫痫患者脑组织(皮质)与神经元标记物(MAP2)共定位,而与星型胶质细胞标记物(GFAP)无共定位。在慢性癫痫小鼠皮质和海马有类似的表达。实验结论:我们的研究发现ZDHHC8在难治性TLE患者和匹罗卡品慢性癫痫大鼠模型脑组织中表达均明显增加,且ZDHHC8在神经元中表达,提示ZDHHC8可能在癫痫的发生及发展有着密切的联系。第二部分ZDHHC8对体内及体外癫痫模型癫痫中动物行为学及癫痫样放电的影响实验目的:为进一步研究ZDHHC8是否参与癫痫发生发展,我们以重组腺相关病毒(rAAV)为载体构建了ZDHHC8敲减病毒(rAAV-ZDHHC8-shRNA)和ZDHHC8过表达病毒(rAAV-ZDHHC8)。通过在小鼠双侧侧脑舒注射病毒改变小鼠海马ZDHHC8蛋白水平表达,观察ZDHHC8对体内癫痫动物模型行为学及体外无镁癫痫模型癫痫样放电的影响。实验方法:1.构建ZDHHC8敲减病毒(rAAV-ZDHHC8-shRNA)、ZDHHC8敲减空病毒(rAAV-Empty(sh)-GFP)、ZDHHC8过表达病毒(rAAV-ZDHHC8)和ZDHHC8过表达空病毒(rAAV-Empty(over)-GFP)。成年雄性C57BL/6小鼠随机分为五组,其中四组双侧侧脑室立体定位注射上述四种ZDHHC8相关病毒,余下的一组(对照组)为不注射任何病毒假手术组。2.分别用免疫荧光、免疫印迹技术检测病毒转染位置及效率,为后续实验选择合适的病毒干预时间;同时检测ZDHHC8同家族成员ZDHHC5的蛋白变化,观察注射病毒后是否特异性的影响ZDHHC8的蛋白变化。HE染色检测病毒对海马组织及神经元有损伤。3.匹罗卡品慢性点燃动物模型行为学观察:在ZDHHC8敲减和ZDHHC8过表达的癫痫模型中,持续视频监测小鼠SRSs情况。用Racine评分评估发作级别,统计SRSs次数和潜伏期。免疫印迹技术检测各组有自发性小鼠海马ZDHHC8蛋白水平变化。4.KA慢性癫痫动物模型行为学观察:在敲减ZDHHC8和过表达ZDHHC8的癫痫模型中,持续视频监测小鼠SRSs情况。用Racine评分评估发作级别,统计SRSs次数和潜伏期。在有稳定SRSs小鼠中记录局部场电位,观察癫痫样放电的频率和每次癫痫样放电持续的时间。免疫印迹技术检测各组有自发性小鼠海马ZDHHC8蛋白水平变化。5.体外无镁癫痫脑片模型癫痫样放电观察:各组小鼠(注射ZDHHC8相关病毒和假手术组)待病毒稳定表达三周后制作成急性海马脑片。采用全细胞膜片钳技术在无镁脑脊液中记录海马CA1区单个锥体神经元自发性放电情况,分析平均放电频率(AP),阵发性去极化漂移(PDS)频率就每次PDS中AP的个数。细胞外记录CA1区脑片场电位变化,分析发作样癫痫样放电事件和间期样发作癫痫样放电频率及持续时间。实验结果:1.rAAV-ZDHHC8-shRNA、rAAV-Empty(sh)-GFP、rAAV-ZDHHC8和rAAV-Empty(over)-GFP在侧脑室立体定位注射后,免疫荧光结果显示海马CA1和齿状回均神经元有GFP阳性表达。免疫印迹结果显示,与相应时间点对照组相比,rAAV-ZDHHC8-shRNA组ZDHHC8蛋白水平在病毒注射后第1周降低不明显(**P<0.01),第3周和第5周显著降低(**P<0.01,***P<0.001),而rAAV-ZDHHC8组ZDHHC8蛋白水平在病毒注射后第3周和第5周也显著增加(***P<0.001)。同家族成员ZDHHC5的蛋白水平在各组,第1周、第3周和第5周均无明显变化(*P>0.05)。2.HE染色提示小鼠在注射表达ZDHHC8腺相关病毒后,和未注射病毒的对照组相比,海马及皮质均没有形态学改变;TUNNEL染色也提示注射ZDHHC8腺相关病毒后,各组小鼠无明显细胞凋亡(*P>0.05)。3.匹罗卡品诱导的慢性自发性发作期内(评估SE后30天),与对照组相比,rAAV-ZDHHC8-shRNA组小鼠自发性发作次数显著降低,潜伏期延长,ZDHHC8过表达小鼠自发性发作次数显著升高,潜伏期缩短(*P<0.05,**P<0.01)。有自发性发作的小鼠(观察完行为学后)海马ZDHHC8的表达水平在rAAV-ZDHHC8-shRNA组降低,rAAV-ZDHHC8增高(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)和行为学表现一致。4.KA诱导的慢性自发性发作期内(SE后30天),与对照组相比,rAAV-ZDHHC8-shRNA组小鼠自发性发作次数显著降低,潜伏期延长,在局部场电位记录中,癫痫样放电的频率和每次痫样放电持续的时间显著降低;ZDHHC8过表达后小鼠自发性发作次数显著升高,潜伏期缩短,而局部场电位中癫痫样放电的次数增加,但每次痫样放电持续的时间无显著变化。有自发性发作的小鼠(观察完行为学后)海马ZDHHC8的表达水平在rAAV-ZDHHC8-shRNA组降低,在过表达ZDHHC8组增高,和行为学表现一致(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。5.体外无镁癫痫急性海马脑片模型中:与对照组相比,rAAV-ZDHHC8-shRNA组小鼠CA1区单个锥体神经元AP放电频率、PDS频率、PDS中AP的个数、发作样癫痫样放电和发作间期癫痫样放电频率及持续时间显著减低;ZDHHC8过表达后AP频率、PDS频率、PDS中AP的个数、发作样癫痫样放电和发作间期癫痫样放电频率及持续时间显著增加(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。实验结论:1.重组腺相关病毒rAAV-ZDHHC8-shRNA和ZDHHC8过表达侧脑室立体定位注射后能显著改变海马ZDHHC8的表达水平,病毒转染在注射后3周表达达高峰,并稳定高水平表达到第5周持续至行为学结束;对海马组织形态及神经元没有损伤。2.重组腺相关病毒rAAV-ZDHHC8-shRNA能减轻匹罗卡品诱导的慢性期自发性发作的次数和延长潜伏期,过表达ZDHHC8则导致自发性发作的次数增加和缩短潜伏期。3.重组腺相关病毒rAAV-ZDHHC8-shRNA能减轻KA诱导的慢性期自发性发作的次数、癫痫样放电的频率、癫痫样放电持续时间和延长潜伏期,而过表达ZDHHC8则导致相反的结果,但不能导致癫痫样放电持续时间延长。4.在体外无镁癫痫急性海马脑片模型中,注射rAAV-ZDHHC8-shRNA小鼠脑片CA1区单个锥体神经元的APs频率、PDSs频率、PDS中AP的个数、发作样癫痫样放电和发作间期癫痫样放电频率及持续时间显著减低,过表达ZDHHC8则导致相反的结果。第三部分ZDHHC8调节癫痫易感性的可能机制实验目的:探讨ZDHHC8调节癫痫易感性的可能机制。实验方法:1.取成年雄性清洁级C57BL/6小鼠,根据侧脑室内立体定位注射病毒不同分为五组:rAAV-ZDHHC8-shRNA组、rAAV-Empty(sh)-GFP组、rAAV-ZDHHC8组、rAAV-Empty(over)-GFP组和未注射病毒的Control组(各组n=4)。各组小鼠待病毒表达三周后使用,取小鼠脑组织制作急性海马脑片。2.在无镁脑脊液中采用全细胞膜片钳技术记录各组小鼠海马脑片CA1区锥体神经元微小兴奋性后突触后电流(mEPSC)、微小抑制性突触后电流(mIPSC)。免疫荧光检测ZDHHC8在癫痫患者脑组织中和有自发性发作的癫痫小鼠中抑制性和兴奋性神经元和突触前后的表达情况。3.在无镁脑脊液中采用全细胞膜片钳技术记录各组小鼠海马脑片CA1区锥体神经元电刺激诱发的:AMPA电流(eAMPA)和NMDA电流(eNMDA),比较eAMPA/eNMDA幅值绝对值的比值;成对双脉冲比率(PPR);AMPA整流,比较各组整流指数(RI);及给予不包含GluA2亚基的AMPA受体(钙渗透性AMPA受体亚基)阻断剂IEM-1460,观察灌流前后AMPA/NMDA比值前后变化。4.免疫共沉淀检测匹罗卡品诱导慢性点燃成功后小鼠海马中ZDHHC8和Glu A1、Glu A2、Glu A3、Glu A4相互作用情况。5.免疫印迹法检测匹罗卡品和KA诱导的慢性点燃成功后小鼠海马Glu A1总蛋白、膜蛋白和胞浆蛋白表达情况。GABA-A受体亚基β2/3膜蛋白表达情况。实验结果:1.CA1区锥体神经元膜片钳记录结果显示,rAAV-ZDHHC8-shRNA组小鼠海马脑片相比于对照组,mEPSC幅度显著降低(***P<0.001);过表达ZDHHC8导致mEPSC幅度增加(*P<0.05)。而mEPSC的频率、mIPSC幅值和频率在rAAV-ZDHHC8-shRNA组与ZDHHC8过表达组之间无显著性差异(P>0.05)。免疫荧光显示,在癫痫患者和慢性癫痫小鼠模型脑组织中ZDHHC8不与DAPI重合,表达在细胞膜上。与兴奋性突触后标记物(PSD95)共表达,不与兴奋性突触前标记物(VGLUT1)共表达。与抑制性神经元标记物(GAD67)和成熟的抑制性突触前标记物(Gephyrin)均不表达。2.CA1区锥体神经元膜片钳记录结果显示,rAAV-ZDHHC8-shRNA组小鼠海马脑片相比于对照组,AMPA/NMDA幅值绝对值的比值显著下降,AMPA电流显著下降而NMDA电流无明显变化,RI显著降低,AMPA/NMDA幅值比值给予IEM-1460后显著下降(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001);ZDHHC8过表达后则产生相反的变化。而PPR无论在ZDHHC8敲减组还是ZDHHC8过表达组均没有显著变化。3.免疫共沉淀结果提示ZDHHC8仅和Glu A1相互作用,和Glu A2、Glu A3、Glu A4不相互作用。4.免疫印迹法结果显示在rAAV-ZDHHC8-shRNA组海马Glu A1膜蛋白/总蛋白比值显著减少(**P<0.01)、GluA1胞浆蛋白/总蛋白比值显著增加(*P<0.05);ZDHHC8过表达后,膜蛋白/总蛋白比值明显增加(*P<0.05),GluA1胞浆蛋白/总蛋白比值显著减少(***P<0.001);GABA-A受体β2/3膜蛋白在各组均无明显变化(P>0.05)。实验结论:1.在癫痫环境中,敲减和过表达ZDHHC8仅能调节mEPSC的幅值,不影响其频率和mIPSC的幅值和频率;免疫荧光提示在TLE患者和癫痫小鼠脑组织中ZDHHC8仅在兴奋性突触后膜中表达;这些表明ZDHHC8通过调节兴奋性突触后电流影响兴奋性突触传递。2.在癫痫状态下,ZDHHC8通过调节钙渗透性AMPA受体GluA1亚基在海马细胞膜上的蛋白表达量从而影响癫痫易感性。