目的:严重创伤后皮肤创面延迟不愈严重影响患者生活质量。为建立皮肤创面愈合不同速率的干预标准,探讨皮肤创面延迟愈合的分子机制,我们研究了巨噬细胞分化在延迟愈合的慢性皮肤创面基质重塑期的作用,同时借助二代测序及生物信息学分析我们进一步发现M2型巨噬细胞在皮肤创面延迟愈合组织中浸润减少,与此同时我们发现AKT3(AKT Serine/Threonine Kinase 3)也在延迟愈合的创面组织中显著下调。因此,我们进一步研究了AKT3在巨噬细胞分化及慢性皮肤创面不愈基质重塑期中发挥的作用。随后,我们构建了AKT3基因敲除小鼠模型并探究皮肤创面愈合的变化及对M2型巨噬细胞浸润及分化的影响。方法:1、取自创伤后皮肤创面延迟愈合及愈合速率正常的患者小腿处皮肤组织,分别进行石蜡包埋固定后组织HE、Masson、EVG染色观察皮肤创面延迟愈合及愈合速率正常组织在形态、胶原纤维及弹力纤维含量的差异;同时,免疫组织化学法观察在上皮化分子指标CK5、上皮增殖速率指标PCNA在皮肤创面延迟愈合及正常愈合组织的表达差异,Tunel法检测皮肤创面延迟愈合及正常愈合组织凋亡率的变化。2、将皮肤创面延迟愈合及正常愈合组织进行Trizol法抽提RNA,随后进行转录组学测序并进行聚类分析,GO(Gene Ongology)、KEGG功能分析寻找皮肤创面延迟愈合及正常愈合组织发挥关键作用的功能聚类及信号通路。对GO、KEGG聚类分析所得到的关键功能及信号通路进一步进行Venn法分析并绘制热图并富集到关键分子,再进一步GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)寻找与GO、KEGG分析所得的关键功能及信号通路相关的富集分子。3、通过免疫组织化学法及免疫印迹法检测AKT3、COL1A1及COL11A1在皮肤创面延迟愈合及正常愈合组织中的表达变化;免疫印迹法检测磷酸化AKT3分子在皮肤创面延迟愈合及正常愈合组织中的表达。4、对巨噬细胞功能及PI3K-AKT信号通路进行GSEA分析并绘制热图筛选显著富集的10个分子;组织免疫荧光法标记CD68/CD206阳性巨噬细胞及AKT3,分析AKT3表达定位与M2型巨噬细胞的关系。流式细胞分选CD68/CD206双阳性的M2型巨噬细胞,实时定量PCR(q RT-PCR)法检测CD68/CD206双阳性的M2型巨噬细胞中AKT3表达变化;免疫印迹法检测CD68/CD206双阳性的M2型巨噬细胞中AKT3及磷酸化的AKT3表达变化;组织免疫荧光标记法检测COL1A1、COL11A1与CD68阳性的巨噬细胞表达定位及定量关系。5、将THP-1诱导为M2型巨噬细胞,并采用q RT-PCR法检测诱导效率;在THP-1诱导后M2型巨噬细胞中敲减AKT3并采用免疫印迹法检测敲减效率;在体外建立人真皮成纤维细胞(HSF)与M2型巨噬细胞(THP-1诱导及组织分选)共培养体系,分为四组空白对照(HSF),THP-1+HSF共培养组,M2型巨噬细胞+HSF共培养组,M2型巨噬细胞敲减AKT3+HSF共培养组;CCK-8、Ed U检测四组HSF细胞的增殖能力;迁移率实验检测四组HSF细胞迁移速率,同时采用免疫印迹法检测四组HSF细胞COL1A1、COL11A1蛋白质表达水平变化。6、构建AKT3全身敲除的小鼠,并采用免疫印迹法检测敲除效率;采用皮肤打孔法在AKT3全身敲除的小鼠后背打孔模拟皮肤创面,观察0、7、14天对照组及AKT3全身敲除组小鼠皮肤创面愈合速率的差异。组织学染色HE、Masson、EVG观察对照组及AKT3全身敲除组小鼠皮肤创面组织在形态、胶原蛋白及弹力蛋白表达上的差异;组织免疫荧光染色观察对照组及AKT3全身敲除组小鼠皮肤创面F4/80、CD206小鼠M2型巨噬细胞浸润数量差异;免疫印迹法检测对照组及AKT3全身敲除组小鼠皮肤创面COL1A1、COL11A1蛋白表达变化,免疫组织化学法检测对照组及AKT3全身敲除组小鼠皮肤创面COL1A1、COL11A1的表达差异。QRT-PCR法检测对照组及AKT3全身敲除组小鼠皮肤创面7、14天TGF-β、IL-10表达差异。7、流式细胞法分选对照组及AKT3全身敲除组小鼠皮肤创面组织M2型巨噬细胞,并检测分选的M2型巨噬细胞中AKT3表达量。建立M2型巨噬细胞与小鼠JB6细胞共培养体系,CCK8、Ed U法检测共培养后JB6细胞增殖能力;检测共培养后JB6细胞迁移能力变化;免疫印迹法检测共培养后JB6细胞COL1A1、COL11A1蛋白表达变化。结果:1、HE染色结果显示皮肤延迟愈合较愈合速率正常的皮肤组织结构疏松并且包含较多的炎症细胞团块;Masson染色结果显示皮肤延迟愈合较愈合速率正常的皮肤组织胶原纤维及弹力纤维均减少,EVG染色结果同样显示皮肤延迟愈合较愈合速率正常的皮肤组织弹力纤维减少;免疫组织化结果显示延迟愈合较愈合速率正常的皮肤组织CK5、PCNA表达显著下调,Tunel结果提示延迟愈合较愈合速率正常的皮肤组织凋亡率显著上升。2、皮肤创面延迟愈合及正常愈合组织转录组学测序结果提示共有1792个下调基因及1570个上调基因,GO、KEGG功能分析提示皮肤创面延迟愈合及正常愈合组织包含20个主要功能聚类及信号通路,其中包括ECM重塑、ECM接触、细胞黏附等。对PI3K-AKT信号通路,ECM受体接触及细胞黏附三条KEGG进行Venn分析得到35个。对细胞黏附、细胞迁移、细胞外基质重塑、胶原纤维重塑、多细胞内功能六个GO富集功能进行Venn分析富集得出AKT3、COL1A1、COL11A1在皮肤创面延迟愈合组织中下调。进一步对细胞黏附分子、胶原代谢过程、黏附及胞外结构重塑等分子进行GSEA分析发现皮肤创面延迟愈合组织中显著下调。免疫组织化学法及免疫印迹法检测结果提示在皮肤创面延迟愈合组织中AKT3、COL1A1及COL11A1表达下调;免疫印迹法检测在皮肤创面延迟愈合组织中磷酸化AKT3分子表达下调。3、对巨噬细胞功能及PI3K-AKT信号通路进行GSEA分析并绘制热图筛选显著富集的10个分子;组织免疫荧光法标记结果提示CD68/CD206阳性巨噬细胞及AKT3在皮肤创面组织中共定位,并且CD68/CD206/AKT3阳性细胞数目显著减少。流式细胞分选CD68/CD206双阳性的M2型巨噬细胞,实时定量PCR(q RT-PCR)法检测CD68/CD206双阳性的M2型巨噬细胞中的AKT3发现AKT3表达显著下调;免疫印迹法检测CD68/CD206双阳性的M2型巨噬细胞中AKT3及磷酸化的AKT3表达下调;组织免疫荧光标记法检测COL1A1、COL11A1与CD68在皮肤创面延迟愈合组织中表达下调。5、QRT-PCR法检测M2型巨噬细胞标志物CD206、CD163表达显著上调;在THP-1诱导后M2型巨噬细胞中敲减AKT3并采用免疫印迹法检测发现AKT3表达显著下调,并且敲减AKT3后M2极化受到影响;在体外建立人真皮成纤维细胞(HSF)与M2型巨噬细胞(THP-1诱导及组织分选)共培养体系,分为四组空白对照(HSF),THP-1+HSF共培养组,M2型巨噬细胞+HSF共培养组,M2型巨噬细胞敲减AKT3+HSF共培养组;CCK-8、Ed U检测四组HSF细胞的增殖能力发现M2型巨噬细胞+HSF共培养组HSF细胞增殖能力最强,敲减AKT3后HSF增殖能力减弱;迁移率实验检测发现M2型巨噬细胞+HSF共培养组HSF细胞迁移速率最快,敲减AKT3后迁移能力减弱。同时免疫印迹法检测四组HSF细胞COL1A1、COL11A1蛋白质表达水平,结果提示M2型巨噬细胞+HSF共培养组HSF细胞COL1A1、COL11A1蛋白水平显著上调,而敲减AKT3后蛋白表达下降。6、免疫印迹法检测AKT3敲除小鼠皮肤组织AKT3表达显著下调;AKT3全身敲除的小鼠皮肤创面愈合速率7、14天较对照组减慢。HE染色结果显示AKT3全身敲除的小鼠皮肤创面较对照组小鼠皮肤创面组织结构疏松并且包含较多的炎症细胞团块;Masson染色结果显示AKT3全身敲除的小鼠皮肤创面较对照组小鼠皮肤创面组织胶原纤维及弹力纤维均减少,EVG染色结果同样显示AKT3全身敲除的小鼠皮肤创面较对照组小鼠皮肤创面组织弹力纤维减少。组织免疫荧光染色结果显示AKT3全身敲除组小鼠皮肤创面F4/80、CD206小鼠M2型巨噬细胞浸润数量减少;免疫印迹法检测发现AKT3全身敲除组小鼠皮肤创面COL1A1、COL11A1蛋白表达下调,免疫组织化学法检测结果提示AKT3全身敲除组小鼠皮肤创面COL1A1、COL11A1的表达下调。QRT-PCR法检测对照组及AKT3全身敲除组小鼠皮肤创面7、14天TGF-β、IL-10表达差异发现,AKT3敲除组小鼠皮肤创面组织TGF-β、IL-10表达。7、流式细胞法分选对照组及AKT3全身敲除组小鼠皮肤创面组织M2型巨噬细胞,免疫印迹并检测发现AKT3敲除小鼠皮肤创面分选的M2型巨噬细胞中AKT3表达显著下调。建立M2型巨噬细胞与小鼠JB6细胞共培养体系,CCK8、Ed U法检测发现AKT3敲除小鼠皮肤创面分选的M2型巨噬细胞共培养后JB6细胞增殖能力相比于对照组来源的M2型巨噬细胞显著减弱;AKT3敲除小鼠皮肤创面分选的M2型巨噬细胞共培养后JB6细胞迁移能力减弱;免疫印迹法检测AKT3敲除小鼠皮肤创面分选的M2型巨噬细胞共培养后JB6细胞COL1A1、COL11A1蛋白表达下调。结论:1、皮肤创面延迟愈合组织重塑期障碍是导致延迟愈合的主要原因;组织结构疏松、胶原纤维、弹力纤维生成障碍以及组织中残存细胞凋亡率上升共同导致皮肤创面延迟愈合。2、导致皮肤创面基质重塑期异常的主要基质是M2型巨噬细胞浸润减少及COL1A1、COL11A1表达下调。3、M2型巨噬细胞AKT3缺失是导致M2型巨噬细胞浸润减少及极化异常的主要机制,M2型巨噬细胞AKT3缺失同时导致创面成纤维细胞COL1A1、COL11A1表达及外分泌减少。