茶籽饼粕多肽的制备、纯化及抗氧化活性研究

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探索茶籽粕蛋白的深度开发技术,制备出具有抗氧化活性的多肽,对于开发新型功能性食品具有重要的学术和经济意义。本论文以茶籽饼粕为原料,首先经超声波预处理酶解制备抗氧化肽,利用体外化学模型评价茶籽粕多肽的抗氧化活性和功能性质,再进一步采用现代分离技术对茶籽粕多肽进行分离纯化,反相高效液相色谱技术对目标肽段进行氨基酸组成分析。主要结论如下:1、以茶籽粕多肽的还原力为评价指标,研究超声波预处理条件对酶解茶籽粕蛋白制备抗氧化肽的得率和抗氧化活性的影响。结果显示超声波预处理茶籽粕蛋白后再酶解,酶解产物的还原力吸光值由从0.384提高到0.566,后经正交实验优化得到最佳工艺参数为:超声功率720W,超声温度60℃,超声时间40min。将在上述条件下处理的茶籽粕蛋白用胰蛋白酶酶解,酶解条件为底物浓度3%,温度45℃,时间2.5h,加酶量0.6%,pH值为8.0,得到抗氧化肽的还原力吸光值为0.823,多肽得率38.73%。与未处理的对照组比较发现,超声处理可以显著提高抗氧化肽的得率和抗氧化活性,其中多肽得率提高32.5%,·OH清除率、O2-·清除率、还原力吸光值分别提高79.33%、71.72%、113.8%。2、对茶籽粕多肽的氨基酸组成和功能特性进行研究,主要研究对比了茶籽粕蛋白与茶籽粕多肽的疏水性氨基酸含量、溶解性、持水性、乳化性质、起泡性质等功能特性的差异。结果表明:茶籽粕多肽的疏水性氨基酸含量为34.35%,比茶籽粕蛋白增加了10.13%;在pH=5时,茶籽粕多肽的溶解度达71.2%,比茶籽粕蛋白的溶解度提高了84%,多肽的持水性(1.52g/g)比茶籽粕蛋白持水性(0.94g/g)提高了61.7%,乳化性从0.058提高到0.35,而乳化稳定性却略有降低。多肽的起泡性和起泡稳定性比茶籽粕蛋白分别提高了198%和11.6%。在pH<6的酸性范围内,茶籽粕多肽分别经121℃高温处理和-18℃低温处理后,其溶解度降幅较大,pH=6时分别从80.8%降低到67.6%和64.7%;而在碱性范围内,茶籽粕多肽经121℃高温处理和-18℃低温处理后,其溶解度在65%以上,具有较好的热稳定性和冻藏稳定性。3、以羟自由基清除能力为指标,采用超滤、凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱等技术对茶籽粕多肽进行分离纯化。茶籽粕多肽通过5kDa的超滤膜被分离成两部分,分子量<5kDa的组分CSMP-2清除·OH的活性较高,IC50值为9.8mg/mL;然后将CSMP-2经凝胶色谱进一步分离成五个组分,其中组分CSMP-2D的清除羟自由基活性最高,其IC50为2.1mg/mL,由分子量分布图推测组分CSMP-2D是分子量为793Da的多肽,由8个氨基酸残基组成。将CSMP-2D再用反相高效液相色谱法进行分离,所得组分CSMP-2D-b具有最高的羟自由基清除能力,其IC50为1.05mg/mL,清除·OH的能力比分离前提高了6.13倍,说明分离纯化可显著地富集抗氧化肽。用RP-HPLC对功能肽段的氨基酸组成进行分析,结果显示与未分离纯化前相比,CSMP-2D-b的疏水性氨基酸含量提高到84.79%,其中酪氨酸和苯丙氨酸这两种与抗氧化活性相关性较强的疏水性氨基酸的含量约从10.37%增加到72.51%。
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