目的:慢性炎症与肿瘤关系密切,血管内皮细胞在炎症和肿瘤的病理过程中发挥重要作用。本研究以内毒素(LPS)激活血管内皮细胞,释放炎症介质和粘附分子,探索内皮细胞NF-κB-Jmjd3信号轴在内皮细胞炎症反应过程的的作用,并分析其可能的表观遗传学调控机制,为有效抑制血管炎症反应,寻找相关疾病治疗靶点,提供实验依据。方法:1.细胞培养及分组:复苏并常规培养原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs),随机分为对照组与LPS实验组,实验组按照不同检测指标要求,予LPS刺激不同时间段后取样待测。2、LPS诱导内皮细胞炎性介质和粘附分子的表达释放:ELISA试剂盒检测细胞上清液中IL-6、MMP-9和ICAM-1与表达变化;3、NF-κB/p65、Jmjd3的表达与定位:免疫荧光实验观察NF-κB/p65、Jmjd3的表达与定位变化;RT-PCR检测Jmjd3 RNA水平的表达变化;蛋白质免疫印迹法验证NF-κB/p65,IκBα和Jmjd3的表达变化;4、NF-κB/p65转录因子活性测定:Millipore转录因子试剂盒检测胞核NF-κB/p65蛋白活性;5、染色质免疫共沉淀技术分析目标基因的转录起始结合位点区域NF-κB/p65、Jmjd3、H3K27me3的募集关系:应用Millipore染色质免疫共沉淀试剂盒建立目标DNA文库,Ch IP-q PCR分析在目标基因IL-6、MMP-9和ICAM-1转录起始结合位点NF-κB/p65、Jmjd3、H3K27me3的募集关系。结果:1、LPS诱导内皮细胞炎性介质和粘附分子的表达释放:细胞上清液中IL-6、MMP-9和ICAM-1分别与相应的对照组相比表达显著升高,差异均具有统计学意义(P<0.01)。2、NF-κB-Jmjd3信号通路的活化:(1)NF-κB/p65免疫荧光实验中LPS各组与空白对照组(0h组)相比,随着刺激时间增加整体荧光强度逐渐增加,NF-κB/p65表达上调,并逐渐向转胞核内聚集,核转位高峰为2 h。(2)NF-κB/p65转录因子活性测定:LPS刺激2h组中NF-κB/p65蛋白相对活性显著高于对照组(0h组)(P<0.01),余各实验组与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。(3)RT-PCR检测Jmjd3 RNA水平变化:LPS 2h组RNA水平显著高于对照组(0h组),差异有统计学意义(P<0.01),余各实验组与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。(4)Jmjd3免疫荧光实验中LPS各组与对照组(0h组)相比Jmjd3的表达均上调,其中于1h和2h上调明显。(5)蛋白质免疫印迹法验证总NF-κB/p65蛋白随着LPS刺激时间增加表达逐渐上调;胞核NF-κB/p65蛋白于2h和6h表达明显上调;IκBα蛋白于LPS 2h和4h组表达明显下调;Jmjd3表达亦上调,于1h和2h上调明显。(6)染色质免疫共沉淀技术分析目标基因转录起始结合位点NF-κB/p65、Jmjd3和H3K27me3的募集关系:NF-κB/p65关联DNA文库中IL-6、MMP-9的相对扩增量与相应的对照组相比显著升高(P<0.01),而ICAM-1与相应对照组相比升高,但差异无统计学意义(P>0.05);Jmjd3关联DNA文库、H3K27me3关联DNA文库中目标基因扩增结果与NF-κB/p65关联DNA文库扩增结果一致。结论:LPS诱导内皮细胞中NF-κB-Jmjd3信号通路激活,活化高峰时间为2h:NF-κB信号通路活化后释放转录因子入核结合到Jmjd3相应启动子区域,调控Jmjd3表达,上调的Jmjd3入核作用于目标基因区域组蛋白H3K27me3使其去甲基化、改变构象,从而暴露目标基因转录起始序列,NF-κB通路的活化时也调控转录因子本身表达,上调的核因子-κB结合到暴露的转录起始序列上调控目标基因的转录,引起炎症介质和粘附分子的表达影响内皮细胞微环境,导致炎症相关病理过程。