1.研究背景：自噬(autophagy)是将细胞内受损、变性或衰老的蛋白质以及细胞器运输到溶酶体进行消化降解的代谢过程。根据细胞内物质运输到溶酶体途径的差异,自噬可分为大自噬(macroautophagy),小自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy)三种主要类型。其中大自噬即我们通常所说的自噬,因为它具有最典型的自噬过程,也是各个领域研究的热点。细胞自噬的发生是以胞质内出现自噬体(autophagysome)为主要特征,它是一种由双层膜包裹的细胞内需要降解的细胞器,蛋白质等成分构成,最终与溶酶体结合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的底物,实现细胞本身的代谢需要和部分细胞器的更新。在生理状况下,自噬的活性常常处于基础状态,当细胞受到各种内外刺激时,比如饥饿、缺氧或其他代谢应激,自噬的活性也随之发生改变。经典的自噬激活途径是饥饿,当细胞面临能量缺乏时,自噬的活性也随之上调,最终的结果是降解细胞内的长寿命蛋白质、衰老蛋白质等,从而为细胞提供能量或其他代谢所需的中间产物。细胞通过自噬还能抑制活性氧(ROS)的产生,减少DNA的损伤和维持染色体的稳定,对于对抗衰老和癌变起着重要作用。另外,自噬作为第二种程序性的细胞死亡方式(区别于细胞凋亡),可在细胞无法继续维持自身生存时诱导细胞发生自噬性死亡(autophagy cell death)。鉴于自噬在细胞中有如此重要的功能,因此人们越来越关注自噬在肿瘤发生、发展中所起的作用。目前研究认为,自噬在肿瘤的发生发展中起着双重作用(two-edged sword)。一方面通过维持细胞内环境和基因的稳定性,抑制正常细胞的恶性转变；另一方面,自噬作为一种对代谢应激和环境变化的适应,给肿瘤细胞提供了更多的生存机会。肿瘤是由一群快速增殖的细胞构成,其生长需要消耗大量的能量,而肿瘤组织内常常血管生成不足(尤其是肿瘤中心地带),所以肿瘤细胞经常面临着缺氧和能量的缺乏。在这种情况下,肿瘤细胞的自噬活性往往是升高的,肿瘤细胞通过自噬作用,维持细胞的基本生存能力。目前已有大量证据表明,在实体肿瘤中,肿瘤自噬水平是异常升高的,且升高的自噬水平与病人的不良预后呈正相关。目前尚有证据表明,肿瘤的自噬水平与肿瘤的耐药性也是密切相关的,参与了肿瘤药物耐药的发生。因此,阻断自噬过程很有可能成为治疗肿瘤的新手段。微管相关蛋白轻链3(Microtubule-associated protein light chain3, LC3),是酵母中自噬相关基因(autophagy-related gene, ATG) ATG8的同源物。LC3是自噬体的重要组成部分,常作为自噬发生的一个标记性蛋白。LC3蛋白在细胞内存在两种形式：LC3-Ⅰ和它的蛋白水解物LC3-Ⅱ。LC3蛋白合成后,ATG4切掉其C端,形成LC3-Ⅱ,主要分布于细胞浆内。在自噬体形成后,磷脂酰乙醇胺与LC3-Ⅰ偶联形成LC3-Ⅱ,后者牢固地定位于自噬体膜上,直至自噬体与溶酶体融合,最终被溶酶体降解。因此,LC3在自噬过程中发挥着重要作用,LC3的含量代表了自噬体的数目。另外细胞质L3C-Ⅰ向自噬体膜上LC3-Ⅱ的转化也可反映自噬活性的强弱。目前研究表明,在许多恶性肿瘤中LC3蛋白的表达水平是升高的,比如胃肠道肿瘤,胰腺癌等。其表达水平与肿瘤的恶性行为和患者的不良预后呈正相关。目前发现有3种亚型的LC3定位于自噬体膜上,LC3A、LC3B和LC3C。LC3A被证明是自噬激活的重要标志。近年来在一些肿瘤组织中发现,通过免疫组化染色LC3A在光学显微镜下呈现出3种不同的染色形式：弥漫的胞浆表达(diffuse cytoplasmic staining),核周表达(juxtanuclear staining)和“石头样”结构(staining of stone-like structures, SLS)。进一步研究表明不同的染色形式代表了不同的自噬水平：弥漫型的胞浆表达和核周表达代表基础的自噬水平,而“石头样”结构代表激活的或异常升高的自噬水平,后者与肿瘤的进展和患者的不良预后相关,比如乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌等。然而,LC3A在胃癌中的表达形式及预后意义目前尚未报道。本次研究,我们采用免疫组化方法检测了188例胃癌组织及62例癌旁组织,检测LC3A在胃癌中的染色形式,分析每种形式与胃癌临床病理学参数的关系。我们还分析LC3A不同染色形式与胃癌患者无病生存率(disease-free survival,DFS)和总生存率的关系(overall survival, OS),评估LC3A对胃癌患者临床预后的指导意义。2.材料与方法根据病案资料选取南方医科大学南方医院2000年至2010年间收治的胃癌手术病例188例。所有石蜡标本均经南方医院病理科证实为胃腺癌。按照胃癌的Lauren分型,其中肠型胃癌93例,弥漫型胃癌67例,混合型胃癌28例。所有胃癌患者的分期按照国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会(UICC/AJCC2010)。本研究中,148例Ⅰ-Ⅲ期的病人为根治性切除,40例Ⅳ期病人为姑息性切除。病人的中位随访时间为23.1个月,最短的0.5个月,最长的61个月。本研究首先选取大鼠的肝脏,利用Western-blot验证LC3A抗体(AP1805a)的特异性；接着采用免疫组化方法检测了LC3A在胃癌中的表达情况及染色形式,并分析其表达与临床病理学参数之间的关系。应用SPSS16.0软件进行统计学处理。对胃癌组织与癌旁组织的LC3A表达强弱比较采用t检验。用x2检验LC3A的表达与患者临床病理参数(性别、年龄、肿瘤分化程度、肿瘤转移灶数目等)之间的关系；对LC3A的表达与胃癌患者生存期之间的关系进行Kaplan-Meier分析。P值小于0.05被认为有统计学差异。3.研究结果3.1LC3A在胃癌组织及癌旁组织中的表达情况本研究中,我们发现LC3A在胃癌组织中存在2种免疫组化染色形式,即弥漫型的胞浆表达或(和)“石头样”结构,而核周表达在胃癌组织中并没有发现。在癌旁组织中,我们只发现弥漫型胞浆表达。统计学分析表明,LC3A弥漫型胞浆表达在癌组织中明显高于相对应的癌旁组织(p=0.040)。3.2LC3A表达与临床病理学参数的关系在Ⅰ-Ⅲ期胃癌患者中,LC3A"石头样”的结构与胃壁的浸润深度、淋巴结的转移数目、术后复发均有关(P值分别为0.006、0.002、<0.001),而与性别,年龄无关。在Ⅳ期胃癌患者中,LC3A"石头样”的结构与转移灶的数目和腹水的有无呈正相关(P值分别为0.025、0.009)。相反,LC3A弥漫型胞浆表达与上述临床病理学参数均无统计学关系。我们分析了在不同类型的胃癌中,LC3A蛋白表达的差异。我们发现,在弥漫型胃癌中,LC3A"石头样”结构的数目明显高于肠型胃癌(p=0.038),而LC3A弥漫型胞浆表达在肠型胃癌、弥漫型胃癌及混合型胃癌中均无统计学差异。鉴于肿瘤的分期与胃癌患者的复发有关(p<0.001),越晚的肿瘤分期预示越高的术后复发风险,我们也分析了不同分期肿瘤中LC3A蛋白的表达情况。我们发现随着胃癌患者分期的升高,LC3A“石头样”结构的数目也随之增多(p<0.001),然而LC3A弥漫型胞浆表达在不同分期的胃癌中无统计学差异。3.3多因素分析根据Cox风险回归模型,我们发现LC3A"石头样”结构的数目和肿瘤分期是Ⅰ-Ⅲ期胃癌患者术后复发的独立预测因子,且在Ⅳ期胃癌患者中,LC3A"石头样”结构数目还是胃癌患者死亡的独立预测因子。3.4LC3A蛋白的表达与胃癌患者预后的单因素分析Kaplan-Meier法分析表明,在Ⅰ-Ⅲ期胃癌患者中,高表达LC3A"石头样”结构的胃癌患者具有更高的术后复发风险(HR=0.205；P<0.001),高表达LC3A"石头样”结构的胃癌患者的中位复发时间为12个月,而低表达LC3A"石头样”结构的胃癌患者的中位复发时间为40个月。在Ⅳ期胃癌患者中,高表达LC3A"石头样”结构的胃癌患者具有更高的死亡风险(HR=0.364；P<0.001),高表达LC3A"石头样”结构的胃癌患者的中位生存时间为3.55个月,而低表达LC3A"石头样”结构的胃癌患者的中位生存时间为13.6个月。相反,LC3A弥漫型胞浆表达与胃癌患者术后复发时间及生存时间均无统计学差异。4.研究小结1.LC3A在胃癌组织中存在2种免疫组化染色形式(弥漫型胞浆表达和“石头样”结构),且“石头样”结构仅存在于癌组织中。与癌旁组织相比,LC3A弥漫型胞浆表达水平在癌组织中是明显升高的,提示胃癌组织的自噬水平是上调的。2.LC3A"石头样”结构与胃壁的浸润深度、淋巴结的转移数目、lauren分型、术后复发均有关。生存分析表明,高表达LC3A"石头样”结构的患者具有更高的术后复发风险和较短的生存时间。3.LC3A的不同免疫组化染色形式代表了不同的自噬水平,弥漫型胞浆表达代表了基础的自噬水平,而“石头样”结构代表了过度的自噬水平,是胃癌患者预后差的一个不良因素。