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电致化学发光(Electrochemiluminescence，ECL)是一类由电氧化还原产生的化学发光，因此它既有电化学的优势也有化学发光的优点。并且相比于荧光、光致发光等其他光分析手段，电致化学发光不需要额外的激发光源，背景信号低。此外，ECL检测方法还具有灵敏度高、不需要昂贵的检测仪器等优势。半导体量子点（又称半导体纳米晶体，SNCs）作为新型的ECL材料，由于其具有种类多，合成简单，光电性质易于调控等优点，不仅被广泛应用在ECL生物标记和ECL生物传感器中，还催生了很多新的分析原理和方法的产生。我们课题组在前期的研究中建立了多种基于能量转移的ECL分析方法，用于检测DNA、酶等生物大分子分析。本论文进一步将这种能量转移技术拓展到肿瘤细胞的检测中，并建立了双电位比率ECL检测新方法等。具体内容如下: 1.纳米金增强CdS NCs ECL的肿瘤细胞检测方法研究 基于金纳米粒子(AuNPs)的表面等离子体共振效应(SPR)可以增强硫化镉半导体纳米晶(CdS NCs)的ECL的现象，我们结合磁性分离来实现HL-60肿瘤细胞的检测。在这个方法中，首先将CdS NCs滴涂到玻碳电极上形成膜，将其作为ECL发光试剂标记捕获DNA-1。Au NPs和磁珠(MB)上分别标记捕获DNA-2和适配体DNA，然后将两种标记物一起孵育可以得到MB-Au NPs生物共轭体。在MB-Au NPs生物共轭体中加入HL-60细胞后，由于适配体DNA与HL-60细胞表面的糖蛋白结合能力更强，会释放出DNA-2标记的Au NPs。经过磁性分离后，释放出的DNA-2与电极上CdS NCs标记的DNA-1杂交以后形成双链结构而讲AuNPs带到电极表面。由于Au NPs与CdS NCs之间的相互作用，CdS NCs的ECL强度得到增强。这种方法能够灵敏地检测线性范围为20到1.0×106个/mL的HL-60细胞。 2.比率电致化学发光:DNA传感检测新方法 受双波长比率荧光法可以降低复杂环境对检测结果准确性的影响的启发，我们提出了一个新颖的双电位比率ECL传感方法。以CdS NCs和鲁米诺为ECL发光试剂。以mp53致癌基因作为目标DNA，分子信标(MB)的环状部分是与mp53致癌基因互补的20个碱基。首先，将CdS NCs滴涂到玻碳电极(GCE)上成膜，将MB修饰到CdS NCs/GCE上，鲁米诺修饰的铂纳米粒子(L-Pt NPs)修饰mp53致癌基因后，通过与GCE上的MB杂交从而被捕捉到CdS NCs/GCE表面。在CdS NCs和鲁米诺共同的共反应剂过氧化氢存在时，修饰在玻碳电极上的CdSNCs在-1.25 V vs.SCE产生的ECL信号由于mp53致癌基因连接的L-Pt NPs的靠近而发生猝灭。同时鲁米诺在+0.45 V vs.SCE也会产生ECL发光，并由于PtNPs的催化效应，这个发光信号会显著增强。因此，在我们的体系中，会出现CdSNCs的ECL猝灭和鲁米诺的ECL增强的现象，这都表明了mp-53致癌基因的存在。通过测量两个电位下不同发光物质的ECL强度比率，能够灵敏地检测浓度在5.0 fM到1.0 pM之间的目标DNA。这种双电位比率检测法可以提高检测的准确性，并可以延伸应用到很多其他生物大分子的检测中。 3.双电位电致化学发光法检测端粒酶活性 端粒酶活性检测对了解肿瘤的发病机制以及治疗都有着很大的意义。首先我们合成了双功能化鲁米诺-金纳米粒子(L-Au NPs)，并设计了一种新型双电位ECL法来检测端粒酶的活性。在这种方法中，首先将CdS NCs滴涂在玻碳电极上形成膜，然后通过Cd-S键使得巯基修饰的端粒酶引物DNA修饰到CdS NCs上。在端粒酶存在时，引物DNA会被延伸。然后端粒酶引物DNA与其互补DNA杂交，延伸的部分与L-Au NPs标记的捕捉DNA杂交。在共反应剂过氧化氢存在下，由于L-Au NPs中金的SPR效应，L-Au NPs不仅可以增强在-1.25 V(vsSCE)处的CdS NCs的ECL强度，在+0.45 V时也会产生修饰在其表面的鲁米诺的ECL信号。随着端粒酶浓度增加，延伸的DNA越多，所以杂交上的L-Au NPs会引起两个电位的ECL信号都增加。这种方法可以用来检测从100到9000个HL-60细胞中提取的端粒酶，并且还被用来研究没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)引起的肿瘤细胞的凋亡。在一定的浓度范围内，两个信号增量之比值(ΔECLL-AuNPs/ΔECLCds)在检测不同数量细胞时保持了高度的一致性值，可以用来验证检测结果的可靠性。这种双电位ECL方法在生物分析中避免假阳性或者假阴性方面具有良好的应用前景。 4.多功能金纳米粒子用于端粒酶的可视化检测 G四链体DNA酶既可以催化鲁米诺-过氧化氢体系的电致化学发光，还可以催化其化学发光。基于此，我们设计了G四链体DNA酶-鲁米诺-金纳米粒子多功能化催化剂，以增强鲁米诺-过氧化氢体系的发光信号实现可视化分析。通过刻蚀ITO玻璃，我们制备得到了一个U型图案以形成两个ITO区域，分别作为阳极和阴极，在这个芯片上有7个检测池，因此可以同时进行7个样品的检测。在阳极ITO上修饰了Au NPs后，将端粒酶引物DNA修饰在金纳米粒子上。进而利用HL-60肿瘤细胞中提取的端粒酶来将引物DNA延伸。随后，我们将G四链体DNA酶修饰的L-Au NPs与端粒酶延伸的DNA杂交，从而增强ITO芯片上鲁米诺-过氧化氢体系的发光信号。这种信号变化可以通过肉眼来观察。因此，在这个阵列检测器中我们可以检测到范围在313-10000个HL-60肿瘤细胞中的端粒酶活性。