目的:本研究通过网络药理学及分子对接技术,对中药复方益糖康改善胰岛素抵抗的作用机制进行了预测,同时虚拟筛选其改善胰岛素抵抗的活性成分。完成以上工作后,选取重要通路和重要相关作用机制的相应指标,用经高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验判定合格的胰岛素抵抗模型大鼠的骨骼肌组织予以验证。最后制备中药复方益糖康的含药血清干预经棕榈酸诱导的C2C12 IR模型细胞,以各组细胞形态、细胞活性、葡萄糖消耗量判定中药复方益糖康含药血清的作用效果,同时验证体内实验的相应作用机制,完善中药复方益糖康改善胰岛素抵抗的机制框架,为临床治疗提供参考。材料与方法:论文一:基于网络药理学、分子对接技术预测中药复方益糖康改善胰岛素抵抗的机制并虚拟筛选其中的活性成分通过TCMSP、Dis Ge NET、CTD、Gene Cards、OMIM数据库获取中药复方益糖康中活性成分及胰岛素抵抗疾病靶点,并进行整理与筛选,用TCMSP靶点预测模型预测中药复方益糖康符合筛选标准的活性成分可能作用的靶点,并与胰岛素抵抗的疾病靶点取交集,作为中药复方益糖康改善胰岛素抵抗可能的作用靶点,用Cluster Profile R包进行富集分析。从CTD数据选取2个有直接医学证据、且具有高Inference Score的胰岛素抵抗相关蛋白作为重要蛋白受体;从GEO数据库选取人源组织的测序数据,分析显著差异表达的基因后,结合文献选取2个作为重要蛋白受体;从拟验证通路中选取2个关键靶点作为重要蛋白受体。以上重要蛋白受体确定结合位点后分别与中药复方益糖康符合筛选标准的有效成分运行Vina进行分子对接,虚拟筛选其改善胰岛素抵抗的活性成分并对可能的作用机制进行讨论。论文二:基于AGE-RAGE信号通路的网络药理学动物实验验证研究8周龄健康雄性Wistar大鼠96只,分别设置空白对照组、模型对照组、益糖康高剂量组、益糖康中剂量组、益糖康低剂量组、西药对照组（盐酸吡格列酮）,剂量分别为（40g/kg、20g/kg、10g/kg、1.35mg/kg）,用高糖高脂糖尿病模型诱导饲料联合小剂量STZ腹腔注射建立胰岛素抵抗动物模型并运用高胰岛素-正葡萄糖钳实验验证,模型判定成功后对各组大鼠按要求进行灌胃给药干预。用稳态胰岛素抵抗指数评价给药干预后各组大鼠胰岛素抵抗的变化情况,用免疫组化及免疫蛋白印迹法对AGEs-RAGE信号通路核心蛋白进行验证。论文三:中药复方益糖康对骨骼肌细胞凋亡的影响经大量文献分析,论文二中验证的AGE-RAGE信号通路大部分指标与细胞凋亡有关,本部分拟探究中药复方益糖康是否能抑制骨骼肌细胞凋亡及具体的作用机制。实验动物及饲养、分组、给药方法同论文二。用TUNEL荧光标记法观察各组大鼠骨骼肌组织细胞凋亡的情况,同时用聚合酶链反应技术及免疫蛋白印迹法观察凋亡蛋白Bax、Bcl-2、P53、Caspase3、Caspase9的表达水平。论文四:中药复方益糖康含药血清对C2C12细胞凋亡情况的影响及机制的验证SPF级雄性Wistar大鼠40只,适应性饲养1周后按照体重用随机数字表法分为益糖康高剂量组、益糖康中剂量组、益糖康低剂量组,空白对照组。予益糖康高、中、低剂量组按照已经换算的药物剂量（40g/kg、20g/kg、10g/kg）进行灌胃,空白对照组同时予以等体积的生理盐水,时间1周。末次给药1h后,麻醉后腹主动脉取血,离心后制备各剂量的中药复方益糖康含药血清。培养C2C12细胞,用棕榈酸诱导C2C12细胞胰岛素抵抗模型,将其分为模型对照组、益糖康含药血清高剂量组、益糖康含药血清中剂量组、益糖康含药血清低剂量组、RAGE抑制剂组,将正常C2C12细胞设置为空白对照组,分别用相应剂量的中药复方益糖康含药血清及RAGE抑制剂进行干预。用倒置显微镜观察各组细胞形态变化,CCK-8法检测细胞活力并进行细胞葡萄糖消耗量测定。用流式细胞术观察各组细胞的细胞凋亡比例,用免疫蛋白印迹法观察Bax、Bcl-2、P53、Caspase3、Caspase9的阳性表达水平,用聚合酶链反应技术观察上述重要凋亡蛋白的m RNA表达水平,以验证中药复方益糖康是否通过抑制AGE-RAGE信号通路进而抑制细胞凋亡以改善胰岛素抵抗。结果:论文一:1.通过相应的网站、数据库分析,共获取中药复方益糖康改善胰岛素抵抗的潜在靶点202个,涉及到了对营养物质、血管病变、氧化物质代谢的调节等多个生物过程,与多个细胞器的共同作用及神经递质和肾上腺素受体活性有关,涉及到了多个与神经、炎症、代谢过程有关的通路。2.从CTD数据库选取INSR、NOS3作为重要蛋白受体,从GEO数据库发现GSE73034芯片与本研究有关,是胰岛素抵抗患者与正常健康志愿者骨骼肌组织的测序数据,从中筛选出14个显著差异蛋白,结合文献分析LPL、GRB14有研究意义,因此选取LPL、GRB14作为重要蛋白受体,从拟验证AGE-RAGE通路选取RAGE、JAK2作为重要蛋白受体。3.以上重要蛋白受体通过与中药复方益糖康所有有效成分进行分子对接,发现薯蓣皂苷元、Xambioona、异丹参酮II、Lantadene A、甘草糖苷E、黄芪甲素A、甘草皂苷H2、异丹参酮I、新黄烷酮、甘草皂苷C2、酸浆苦味A、Longikaurin A是中药复方益糖康改善胰岛素抵抗的潜在活性成分,作用机制主要涉及抗炎及抗氧化应激。论文二:1.实验大鼠2型糖尿病、胰岛素抵抗的成模情况:注射STZ后,除去死亡及未成模舍弃的大鼠,共70只大鼠符合2型糖尿病模型,抽检进行高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验后,所抽检的大鼠全部出现胰岛素抵抗。2.中药复方益糖康对各组大鼠HOMA-IR的影响模型组大鼠出现HOMA-IR显著升高,使用各剂量中药复方益糖康及西药干预后,HOMA-IR下降,组间差异有统计学意义（P＜0.05或0.01）。3.免疫组化检测结果:与空白对照组相比,模型对照组、益糖康高、中、低剂量组及西药对照组大鼠骨骼肌组织中AGEs、RAGE、PKCβII、Egr-1、JNK、JAK2、STAT1、STAT3蛋白表达水平显著升高（P＜0.05或0.01）,差异有统计学意义;与模型对照组比较,益糖康高、中、低剂量组及西药对照组大鼠骨骼肌组织中AGEs、RAGE、PKCβII、Egr-1、JNK、JAK2、STAT1、STAT3蛋白表达水平显著降低（P＜0.05或0.01）,差异有统计学意义;与益糖康中剂量组比较,益糖康高剂量组AGEs、RAGE、JNK、Egr-1、STAT1、STAT3表达水平显著降低,差异有统计学意义（P＜0.05或0.01）,PKCβII、JAK2表达差异不具有统计学意义（P＞0.05）;与益糖康中剂量组比较,益糖康低剂量组AGEs、RAGE、PKCβII、Egr-1、JNK、JAK2、STAT1、STAT3表达水平显著升高,差异有统计学意义（P＜0.01）;与益糖康中剂量组比较,西药对照组RAGE表达水平降低,差异有统计学意义（P＜0.05）,AGEs、PKCβII、Egr-1、JNK、JAK2、STAT1、STAT3差异不具有统计学意义（P＞0.05）。4.免疫蛋白印迹法检测结果:与空白对照组相比,模型对照组、益糖康高、中、低剂量组及西药对照组大鼠骨骼肌组织中AGEs、RAGE、PKCβII、Egr-1、JNK、JAK2、STAT1、STAT3蛋白表达水平显著升高（P＜0.05或0.01）,差异有统计学意义;与模型对照组比较,益糖康高、中、低剂量组及西药对照组大鼠骨骼肌组织中AGEs、RAGE、PKCβII、JNK、JAK2、STAT1、STAT3蛋白表达水平显著降低（P＜0.05或0.01）,差异有统计学意义,Egr-1表达差异不具有统计学意义（P＞0.05）;与益糖康中剂量组相比,益糖康高剂量组AGEs、RAGE、PKCβII、JNK、JAK2、STAT3蛋白表达水平显著降低（P＜0.05或0.01）,差异有统计学意义,Egr-1、STAT1蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）;益糖康低剂量组上述指标蛋白表达水平升高,差异有统计学意义（P＜0.01）。西药对照组与益糖康中剂量组相比,AGEs蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义（P＜0.01）,RAGE、PKCβII、Egr-1、JNK、JAK2、STAT1、STAT3蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。论文三:1.TUNEL法检测各组大鼠骨骼肌细胞凋亡情况:与空白对照组相比,模型对照组骨骼肌组织阳性凋亡细胞个数明显升高（P＜0.01）;与模型对照组相比,益糖康高、中、低剂量组、西药对照组骨骼肌组织阳性凋亡细胞个数明显降低（P＜0.01）;与益糖康中剂量组相比,益糖康高剂量组阳性凋亡细胞个数减少,益糖康低剂量组阳性凋亡细胞个数升高（P＜0.01）;益糖康中剂量组与西药对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。2.聚合酶链反应技术检测结果:与空白对照组相比,模型对照组Bax、P53、Caspase3、Caspase9 m RNA表达水平明显升高,Bcl-2 m RNA表达水平明显降低,差异有统计学意义（P＜0.01）;与模型对照组比较,益糖康高、中、低剂量组及西药对照组骨骼肌组织Bax、P53、Caspase3、Caspase9 m RNA表达水平明显降低,Bcl-2m RNA表达水平明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05或0.01）;与益糖康中剂量组相比,益糖康高剂量组骨骼肌组织Bax、P53、Caspase3 m RNA表达水平明显降低,Bcl-2m RNA表达水平明显升高,差异有统计学意义（P＜0.01）,Caspase 9 m RNA表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。益糖康低剂量组骨骼肌组织Bax、P53、Caspase3、Caspase9 m RNA表达水平明显升高,Bcl-2m RNA表达水平明显降低,差异有统计学意义（P＜0.05或0.01）;益糖中剂量组与西药对照组相比,Bax、Bcl-2、P53、Caspase3、Caspase9 m RNA表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。3.免疫蛋白印迹法检测结果:与空白对照组相比,模型对照组Bax、P53、Caspase3、Caspase9蛋白表达水平明显升高,Bcl-2蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义（P＜0.01）;与模型对照组比较,益糖康高、中、低剂量组、西药对照组骨骼肌组织Bax、P53、Caspase3、Caspase9蛋白表达水平明显降低,Bcl-2蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义（P＜0.01）;与益糖康中剂量组相比,益糖康高剂量组Bcl-2蛋白表达水平明显升高,Bax、Caspase9蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义（P＜0.05或0.01）,P53、Caspase3蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。益糖康低剂量组Bax、P53、Caspase3、Caspase 9蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05或0.01）,Bcl-2蛋白表达水平差异不具有统计学意义（P＞0.05）;益糖中剂量组与西药对照组相比,Bax、Bcl-2、P53、Caspase3、Caspase9蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。论文四:1.细胞培养情况及胰岛素抵抗模型诱导情况:C2C12经棕榈酸诱导后,出现球型改变,细胞活性及葡萄糖消耗量降低,成功建立胰岛素抵抗模型,用各剂量中药复方益糖康含药血清及RAGE抑制剂干预后情况好转（P＜0.01）。2.流式细胞术结果:与空白对照组相比,模型对照组细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）;与模型对照组相比,益糖康含药血清高、中、低剂量组、RAGE抑制剂组细胞凋亡率显著降低（P＜0.01）;与益糖康含药血清中剂量组相比,益糖康含药血清低剂量组细胞凋亡率升高,益糖康含药血清高剂量组和RAGE抑制剂组细胞凋亡率降低,以上各组相互组间差异有统计学意义（P＜0.01）。3.免疫蛋白印迹法检测结果:与正常对照组相比,模型对照组Bcl-2蛋白表达水平明显降低,其余蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义（P＜0.01）;与模型对照组相比,益糖康含药血清高、中、低剂量组、RAGE抑制剂组Bcl-2蛋白表达水平明显升高,其余蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义（P＜0.01）;与益糖康含药血清中剂量组相比,益糖康含药血清高剂量组Bcl-2蛋白表达水平升高,Bax、Caspase 3、Caspase 9蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义（P＜0.05或0.01）,P53蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。益糖康含药血清低剂量组Bax、P53、Caspase 3蛋白表达水平升高,差异有统计学意义（P＜0.01）,Bcl-2、Caspase 9蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。益糖康含药血清中剂量组与RAGE抑制剂组相比Bax、Bcl-2、P53、Caspase3、Caspase9蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。4.聚合酶链反应技术检测结果:与空白对照组相比,模型对照组Bax、P53、Caspase3、Caspase9 m RNA表达水平明显升高,Bcl-2 m RNA表达水平明显降低,差异有统计学意义（P＜0.01）;与模型对照组比较,益糖康含药血清高、中、低剂量组、RAGE抑制剂组Bax、P53、Caspase3、Caspase9 m RNA表达水平明显降低,Bcl-2m RNA表达水平明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05或0.01）;与益糖康含药血清中剂量组相比,益糖康含药血清高剂量组Bcl-2 m RNA表达水平明显升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）,Bax、P53、Caspase3、Caspase9 m RNA表达水平明显降低,差异有统计学意义（P＜0.05或0.01）;益糖康含药血清低剂量组Bcl-2 m RNA表达水平明显降低,差异有统计学意义（P＜0.01）,P53、Caspase3、Caspase9 m RNA表达水平明显升高,差异有统计学意义（P＜0.01）,Bax m RNA表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。益糖含药血清中剂量组与RAGE抑制剂组相比,Bax、Bcl-2、P53、Caspase3、Caspase9 m RNA表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。结论:1.网络药理学的结果提示:中药复方益糖康改善IR涉及到了对营养物质、血管病变、氧化物质代谢的调节等多个生物过程,与多个细胞器的共同作用及神经递质和肾上腺素受体活性有关,涉及到了多个与神经、炎症、代谢过程有关的通路,其中AGE-RAGE信号通路是经典的炎症通路,是下一步研究的对象。2.通过分子对接技术成功筛出:薯蓣皂苷元、Xambioona、异丹参酮II、Lantadene A、甘草糖苷E、黄芪甲素A、甘草皂苷H2、异丹参酮I、新黄烷酮、甘草皂苷C2、酸浆苦味A、Longikaurin A是中药复方益糖康改善胰岛抵抗的活性成分,所有重要蛋白受体与中药复方益糖康经筛选后的大部分有效成分的结合力优于吡格列酮。3.中药复方益糖康可以改善胰岛素抵抗,从骨骼肌角度具体过程可能涉及降低AGEs和RAGE水平及其下游靶点以抑制炎症、改善氧化应激状态,主要通过PKCβIIEgr-1、JAK2/STAT1/STAT3两个途径实现。4.AGE-RAGE信号通路与细胞凋亡关系密切,中药复方益糖康能通过抑制AGE-RAGE信号通路提升抗凋亡蛋白Bcl-2与抑制促凋亡蛋白Bax、P53、Caspase3、Caspase9的表达水平以抑制骨骼肌细胞过度凋亡。