DNA双链断裂(DNAdouble strand breaks,DSB)发生后,研究发现有三个主要因素能调控损伤修复方式:细胞类型、细胞所处周期以及受损DNA末端剪切(End Resection)的发生。电离辐射(Ionizing radiation,IR)预处理真核细胞发生DSB后,非同源末端连接(NHEJ)修复灵敏、快速以及不需要特定的染色体形态,是细胞DNA修复的主力军,但是NHEJ修复容易出错;而同源重组修复(HR)不能直接连接DNA末端,需要剪切一小段损伤处5′端的DNA链,同时它还需要同源模板,故被限制在S期和G2期才能激活,却因此也使得DNA修复较为精确。而EXO1和CtIP蛋白正是HR通路中的关键性核酸酶,末端剪切首先由MRN复合体识别DNA断裂末端,协同CtIP外切酶在DNA的3′端切割出较短的悬链;接着招募EXO1等外切酶从5′端方向对悬链进一步剪切至10kb左右,阻止末端DNA被DNA-PKcs和Ku70/80构成的DPK复合物结合,从而激活HR通路,完成精确修复。在此理论基础上,我们可以通过调控核酸酶EXO1和CtIP来介导DNA损伤修复。目的:(1)研究IR诱导DNA双链断裂损伤后,讨论DNA-PKcs不仅可作为NHEJ通路的核心因子,同时也能调控HR通路关键性蛋白EXO1的稳定性,介导HR和NHEJ通路选择的分子机制。(2)预测同源重组通路关键性核酸酶CtIP相互作用蛋白并进一步研究其相互作用。方法:(1)通过对细胞加入DNA-PKcs特异性抑制剂抑制激酶活性或siRNA特异性敲低DNA-PKcs表达后,采用免疫共聚焦荧光(IF),免疫印迹(western blot),RT-PCR以及流式细胞仪等技术手段检测细胞中不同修复通路关键蛋白如EXO1等的变化,研究其调节机制。(2)在PrePPI在线数据库中寻找CtIP相互作用蛋白,挑选感兴趣的蛋白进行验证和研究;使用免疫共沉淀方法(Co-IP)验证两者的相互作用,分别构建CtIP和需要验证蛋白的截断体寻找相互作用位点;利用Frodock 2.0工具对接两者相互作用;最后用IF实验观察CtIP与互作蛋白在细胞内共定位的情况。结果:(1)在细胞中加入DNA-PKcs特异性抑制剂后,提取染色体蛋白,从Western blot结果可见抑制DNA-PKcs活性或敲低DNA-PKcs表达可以影响HR通路;细胞中提前加入NU7441和NU7026处理6 h和8 h后,EXO1的蛋白表达水平增多;CHX和泛素化实验中证明DNA-PKcs活性抑制可以引起EXO1蛋白半衰期延长,使其蛋白稳定性增加,同时EXO1泛素化也相应减弱;TDR双阻滞同步化细胞后,检测EXO1蛋白在G0/G1期蛋白表达弱,而DNA-PKcs(s2056)位点磷酸化加强;与其同时,抑制DNA-PKcs激酶活性,也能影响同步化细胞里的EXO1的泛素化程度。(2)在PrePPI在线数据库中寻找核酸酶CtIP相互作用蛋白,知晓了PLK1是预测分数排名靠前的作用蛋白;内外源验证了CtIP和PLK1蛋白能在细胞里形成蛋白复合物;分别构建PLK1和CtIP蛋白的截断体进一步验证了两者的相互作用,PLK1的KD(Kinase结构域)段、Middle段可与CtIP发生免疫共沉淀,而CtIP则是通过N端的(17-160)氨基酸残基区域与PLK1蛋白反应。Frodock 2.0工具显示CtIP均可与PLK1全长、N端和C端不同截断体形成对接。结论:(1)DNA-PKcs可以通过调节自身激酶活性影响EXO1的泛素化降解过程,从而负调节EXO1蛋白的稳定性;同时敲低DNA-PKcs的表达也能影响EXO1蛋白水平变化,提示DNA-PKcs可通过激酶活性及蛋白表达调控EXO1介导选择HR和NHEJ通路。(2)从生物信息学、分子生物学、细胞生物学和结构生物学等角度,我们证明了蛋白激酶PLK1可以与核酸酶CtIP蛋白发生相互作用,并且根据PLK1与CtIP相互作用的大致区域,说明两者可能共同参与了DNA损伤修复调节和细胞周期调控。