论文部分内容阅读
miR-17-92家族能够通过下调靶基因的表达水平,参与调控细胞周期与细胞凋亡。为了解miR-17-92家族成员在黄牛类胚胎干细胞(黄牛类ESCs)中的表达水平以及miR-17-92基因在黄牛类ESCs中过表达对miR-17-92家族成员的靶基因的表达抑制作用,本研究初步建立了黄牛类ESCs的培养体系;克隆了黄牛miR-17-92基因簇的基因序列,构建了其真核表达载体;通过慢病毒包装与细胞感染使 miR-17-92基因成功的在黄牛类 ESCs中过表达,同时通过RT-PCR检测靶基因E2F1与Bim的mRNA的表达水平。具体研究结果如下: 1、黄牛类ESCs系的初步建立。根据饲养层细胞汇合度不同,设置0％、40%、80%、100%4个试验组,结果显示饲养层汇合度为80%、100%的试验组,黄牛类ESCs的原始克隆形成率高于其他2个试验组(P<0.05);但只有饲养层细胞汇合度为80%左右时,黄牛类ESCs的原始克隆直径增长率最高(P<0.05)。黄牛和水牛的胎儿成纤维细胞分别作为饲养层细胞或者两种细胞混合作为饲养层,对黄牛类ESCs的原始克隆形成率的影响效果不明显(P>0.05)。分别采用机械法和Accutase消化法对黄牛类ESCs进行传代培养,两种传代方法培养得到的第12代黄牛类ESCs均能保持多能性。 2、探讨了 miR-17-92家族成员在黄牛类 ESCs中的表达水平及miR-17-92基因在黄牛类ESCs中过表达对miR-17-92家族成员的靶基因的表达抑制作用。以黄牛卵巢cDNA为模板,采用普通PCR的方法,扩增得到黄牛 miR-17-92基因全长为1022bp。将目的片段连接到 pLVX-IRES-ZsGreen1载体中成功构建真核表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1-miR-17-92。采用目的质粒与NRF、VSVG质粒共转染293T的方法进行慢病毒包装,将得到的慢病毒感染第12代黄牛类ESCs,通过RT-PCR方法检测miR-17-92基因及其靶基因的表达情况。结果表明,与阴性对照组和空白对照组相比,miR-17-92组细胞中 miR-17-92家族各成员的miRNA水平都被上调（P<0.05),而其靶基因 E2F1和Bim的mRNA相对表达量显著下降(P<0.05)。 结论:本研究所建立的分离和培养体系能够较好的分离和培养黄牛类ESCs;通过慢病毒包装与慢病毒感染,构建的pLVX-IRES-ZsGeen1-miR-17-92重组质粒能够使 miR-17-92基因在黄牛类 ESCs中过表达;且miR-17-92基因过表达能够下调靶基因E2F1和Bim的表达。