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西瓜作为一种重要的瓜果作物,在全国各地均有较大的种植面积,产量的高低直接影响着经济收入,而病害的发生会导致瓜果产量减产,造成严重的经济损失。西瓜蔓枯病和西瓜枯萎病均为西瓜上的土传性病害,可以发生在整个生长期,而西瓜炭疽病还能在瓜果运输、储存期间进行侵染,带来损失。西瓜蔓枯病与西瓜枯萎病在茎秆上产生的症状很相似,而西瓜蔓枯病与西瓜炭疽病在叶片上造成的症状相似,对于非专业的植保技术人员难以进行准确的区分。这三种病害的发生规律以及主要的防治方法不完全一样,如能在病害早期对病害进行准确的判断,采取对应的防治措施可以减缓病害的进一步蔓延。以PCR、LMAP为主的现代分子检测技术,可以实现对病害早期的诊断,减少病害带来的损失。在我国防治西瓜蔓枯病主要还是以化学手段为主,以多菌灵为代表的苯并咪唑类杀菌剂防治效果良好,杀菌作用明显,所以长期以来得到广泛的应用,但是由于该药剂作用位点单一,长期使用导致病原菌抗药性的产生,经过西瓜蔓枯病菌对多菌灵抗药性监测的结果,发现在田间抗性菌株已成为优势种群,并且抗性水平很高。传统病原菌抗药性检测的方法,检测花费周期较长,耗时耗力。环介导等温扩增（LAMP）技术作为一种新型的基因扩增方法,能够缩短检测时间,检测结果可视化,并且在整个检测过程中不需要昂贵的仪器设备,所以可以将该技术运用在田间抗药性菌株的检测中,为病害的抗药性治理提供指导。本研究得到的结果如下:1、西瓜蔓枯病菌、西瓜枯萎病菌、西瓜炭疽病菌的三重PCR检测体系为实现能在一个PCR反应体系中将西瓜蔓枯病菌、枯萎病菌、炭疽病菌进行快速的区分,本试验利用RAPD转SCAR分子标记、病原菌功能基因序列比对,获得了这三种病原菌的特异性片段序列,由此设计了三对特异性引物。引物Db-F/Db-R（上游序列为:5’-GGACAACGAGGACCCGAG-3’,下游序列为:5’-GAGAGACCGCATACAAGTTTT-3’）能够在西瓜蔓枯病菌中扩增得到171bp的特异性片段,引物灵敏度为10pg/μL。引物Ku-F/Ku-R（上游序列5’-ATTGCTGGTGTCATTCCG-3’,下游序列5’-TTCATCTGCTCCATCTACTAGT-3’）能在西瓜枯萎病菌中扩增到大小为255bp的特异性片段,引物灵敏度为1pg/μL。引物Co-F/Co-R（上游引物5’-AGCCCTCTACGATAACCCA-3’,下游引物5’-GGATACCACGCTTCGACTG-3’）能够在西瓜炭疽病中扩增得到394bp大小的特异性片段,引物灵敏度为10pg/μL。采用正交试验设计方法对三重PCR反应体系进行了优化。结果得到的最优组合为,在20μL的反应体系中:dNTPs浓度为0.3mmol/L,Mg2+的浓度为1.5 mmol/L,Taq DNA聚合酶的浓度为1.5U,引物Db-F/Db-R浓度为0.35μmol/L,引物Ku-F/Ku-R浓度为0.25μmol/L,引物Co-F/Co-R浓度为0.25μmol/L;PCR扩增反应程序为:预变性95℃,5min,95℃变性,30sec,52℃退火30sec,72℃延伸30sec,共循环35次,最后72℃延伸,10 min。三重PCR检测体系的灵敏度为1 ng/μL。这三对引物建立的PCR体系只能在西瓜蔓枯病菌、西瓜枯萎病菌、西瓜炭疽病菌中扩增得到对应大小的条带,而在其他一些常见病原菌中不能进行扩增,具有较好的特异性,利用上述建立的三重PCR检测体系,可以对田间采集到的发病组织进行快速、准确的病害鉴定,从而为以上三种病害早期的防治提供方法的指导。2、西瓜蔓枯病菌的LAMP检测体系为实现对田间发病组织中西瓜蔓枯病菌的快速检测,本试验利用环介导等温扩增技术建立了西瓜蔓枯病原菌的LAMP检测体系。通过比对分析西瓜蔓枯病原菌、西瓜枯萎病菌和西瓜炭疽病菌的ITS序列,利用primer Explorer Version 4.0在线引物设计网站设计西瓜蔓枯病菌LAMP引物,从8组引物中对引物进行筛选比较,获得一组特异性较强的LAMP检测引物,这组引物的序列信息分别为F3:5’-TGTTCGAGCGTCATTTGT-3’;B3:5’-GTTCAGCGGGTATCCCTACC-3’;FIP:5’-AATCGTTTTGAGGCGAGTCTGCGC-CCTTCAAGCTTTGCTTGGTG-3’;BIP:5’-GAGCGCAGTACATCTCGCGCTT-GATCCGAGGTCAAGAGTGT-3’。本试验中采用羟基萘酚蓝（HNB）作为显色指示剂,根据肉眼观察HNB指示剂反应前后颜色的变化,实现了LAMP检测结果的可视化。试验中对反应体系进行了优化,优化后的10μL的反应体系中,Bst DNA聚合酶浓度为0.16 U,dNTPs浓度为0.8mmol/L,MgSO4浓度为1 mmol/L,HNB的浓度为100μmol/L,内引物浓度1.6μmol/L,外引物浓度0.4μmol/L,反应条件为65℃恒温反应60 min,反应体系能够检测到1ng/μL的基因组DNA。该引物只能在西瓜蔓枯病菌DNA中得到扩增,使HNB从紫罗兰色变为天蓝色,并且产生明显的梯形条带,特异性较好。利用上述建立的LAMP检测体系,可以在2h左右的时间内,达到从田间发病组织中检测出西瓜蔓枯病菌的目的。3、西瓜蔓枯病多菌灵抗性菌株的LAMP检测体系为了缩短对田间西瓜蔓枯病多菌灵抗性菌株的监测时间,提高检测效率,在本试验中基于对西瓜蔓枯病多菌灵抗性菌株抗性机理的研究,以多菌灵高抗性菌株的β-微管蛋白为靶序列,根据LAMP内外引物特异性程度的大小,将突变点置于FIP的3’末端,并在突变点的附近人工引入了一个错配碱基,得到了西瓜蔓枯病多菌灵抗性菌株的LAMP检测引物。该组引物的序列情况分别如下所示,RF3:5’-TACAACGCCACCCTCTCC-3’;RB3:5’-TGAGCTGACCGGGGAAAC-3’;RFIP:5’-TGTCGTAGAGGGCCTCGTTGTC-TTGTCGAGAACTCTGACGCC-3’;RBIP:5’-ACAACCCCTCTTACGGTGACCT-GCAGGTGGTTACACCAGAC-3’。对体系进行优化后,在10μL的反应体系中,Bst DNA聚合酶浓度为0.16 U/μL,dNTPs浓度为0.8 mmol/L,MgSO4浓度为1 mmol/L,HNB的浓度为100μmol/L,内引物浓度为1.6μmol/L,外引物浓度为0.4μmol/L,扩增条件水浴65℃中反应50min,该反应体系能够检测到1ng/μL的基因组DNA。在本试验中,结合传统药剂筛选方法对以上LAMP技术进行了验证,分别对2017、2018年重庆武隆、北碚地区分离出的蔓枯病菌进行监测,药剂筛选方法的结果表明多菌灵抗药性频率为92.16%,LAMP检测体系结果表明多菌灵抗药性频率为88.89%,这两种方法得出的抗性频率大致相同,说明LAMP方法具有一定的可靠性。综上,该LAMP技术具有快速、简便、操作性强等优势,这可以为田间西瓜蔓枯病的抗药性治理提供相应的用药指导。综上所述,本试验建立了一种三重PCR体系,能够在一个PCR反应体系中同时检测、区分田间发病组织中的西瓜蔓枯病菌、西瓜枯萎病菌、西瓜炭疽病菌,该检测体系可以缩减检测的时间与成本。此外,根据西瓜蔓枯病原菌的ITS序列,建立该病原菌的LAMP检测体系,可以更为简便、快速地从发病组织中检测到西瓜蔓枯病原菌。根据西瓜蔓枯病多菌抗性菌株的突变位点,引入人工错配碱基,获得了检测点突变的特异引物,能够鉴定出西瓜蔓枯病多菌灵抗药性菌株,相对于传统药剂筛选的方法,LAMP技术能缩短鉴定时间,提高工作效率,这为病害的监测提供了重要的检测技术。