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目的：1.检测弥慢性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)户Y_盒结合蛋白1(YB-1)的表达情况,探讨其与肿瘤细胞耐药、化疗疗效及预后的关系。2.体外诱导Daudi细胞多药耐药的形成,检测YB-1基因沉默前后Daudi细胞中mdr1基因诱导性表达和细胞耐药特征形成的差异,探讨YB-1蛋白在诱导性多药耐药形成中的作用。3.探讨阿霉素诱导Daudi细胞耐药过程中,YB-1核易位与核蛋白同mdr1启动子Y-box序列结合活力、mdr1基因启动子转录活性以及MAPK/ERK信号通路活化的关系。方法：1.采用Envision两步法检测DLBCL和反应性淋巴结增生(RLH)石蜡标本中YB-1、磷酸化ERK(pERK)和P-gp的表达,分析YB-1的核定位与细胞P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、pERK的相关性,并探讨其与临床参数的关系。2.构建针对人YB-1的特异性shRNA真核表达载体：把被9 bp序列间隔的针对YB-1不同靶序列的三个19 bp的反向重复序列及随机片段,插入携带人U6SnRNA启动子的pGensil-1质粒载体中,分别用PstⅠ和SalI酶切鉴定,并将酶切鉴定正确的重组质粒作测序分析。3.采用脂质体介导的方法将三种人YB-1基因特异性shRNA及随机片段的真核表达载体(YBX1、YBX2、YBX3、pGenesil-1/con)转染进Daudi细胞中,G418抗性筛选两周后获得阳性克隆。取YB-1基因干扰效果最好的细胞株进行后续实验,以转染随机片段的细胞株(Daudi/c)为对照组。4.阿霉素间歇性长期作用于Daudi细胞,诱导细胞耐药,RT-PCR方法检测YB-1、mdr1基因表达情况,FCM检测各组细胞mdr1基因编码的P-gp的表达水平,Western blotting法检测诱导过程中YB-1蛋白表达及其核易位的变化情况,四唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞的生长抑制率(IR)与IC50值,细胞内罗丹明123(Rho123)潴留实验检测P-gp的功能状态。5.采用凝胶迁移滞后实验(EMSA)方法检测各实验组核蛋白与mdr1启动子Y-box序列的结合活性。6.采用染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)实验来进一‘步证实YB-1与mdrl启动子Y-box序列在细胞内特异性结合。7.合成mdrl基因启动子片段以及YB-1结合位点突变序列,克降到荧光素酶报告基因载体PGL3-Basic中,构建pMDR-luc和突变pMDR-Ym-luc重组载体；川脂质体将重组的报告基因载体与内参质粒p-半乳糖苷酶(β-gal)瞬时共同转染Daudi细胞,荧光素酶活性分析mdr1基因启动子活性的改变。8.运用MAPK抑制剂PD98059预处理Daudi细胞1小时后,再加入阿霉素诱导耐药(诱导方法同上),Western blotting法检测ERK蛋白及其磷酸化情况、YB-1蛋白表达及其核易位的变化。RT-PCR检测mdr-1, YB-1基因表达,FCM检测P-gp的表达情况。结果：1.DLBCL组与RLH组的YB-1胞浆阳性表达率差异无显著性(P=0.763),而DLBCL组的YB-1胞核阳性表达率明显高于RLH组(P＜0.05); DLBCL临床Ⅲ-Ⅳ期、结外淋巴组织侵犯及骨髓浸润患者的YB-1胞核阻性表达率和pERK表达强度明显高于Ⅰ～Ⅱ期、结内病变及无骨髓浸润患者,差异有显著性(P<0.05):DLBCL组与jRLH组均出现P-gp的表达,两组的总体表达率差异无显著性(P＞0.05), P-gp的表达强度与DLBCL患者的性别、年龄、临床分期、结内外浸润及有无骨髓浸润无明显相关性(P＞0.05); YB-1的核阳性表达与P-gp的表达强度(γ=0.950,P<0.005)及pERK积分(γ=0.930,P<0.005)均呈正相关；化疗有效组的YB-1核阳性和pERK表达强度表达率明显低于化疗无效组(P<0.038)；化疗有效组的P-gp表达强度显著低于化疗无效组(P<0.001)。2.针对YB-1第5外显子325-343、381-399和430～448位点设计的三个shRNA片段和随机片段成功克降入pGenesil-1质粒中,产生重组质粒YBX1, YBX2, YBX3及pGensil-1/con,酶切及DNA测序分析显示,重组质粒shRNA编码序列与设计片断的序列完全一致,成功构建了针对YB-1的特异性shRNA真核表达载体。3.随着阿霉素作用浓度的增加,时间的延长, Daudi细胞mdrl基因表达逐渐上调,0.03μg/mL阿霉素就可以诱导mdrl基因和蛋白的表达,同时YB-1基因和蛋白表达均增加,并且出现明显的核易位。4.通过脂质体介导的方法将YB-1 shRNA和重组载体转染进Daudi细胞,依次为Daudi/Y1、Daudi/Y2、Daudi/Y3和Daudi/c, RT-PCR(?)去结果显示,随机片段组和未转染组细胞YB-1基因表达量明显高于阳性转染的3组细胞,Daudi、Daudi/c、Daudi/Y1、Daudi/Y2、Daudi/Y3五组细胞以β-actin标化后的YB-1辉度值分别为0.2613±0.026、0.2395±0.011、0.1523±0.016、0.2592±0.029和0.0866±0.015。YBX1、YBX2对YBX3的抑制率分别为(41.0±0.01)%、(13.3±0.12)%和YB-1mRNA结果也显示,阳性转染组.YB-1的蛋白条带强度比(65.7±0.09)%; Western blotting对照组细胞明显减弱。5.以抑制效果最好的进行后续实验,Daudi/Y3为对Daudi/c照,检测显示RT-PCR组阿霉素诱导的Daudi/Y3基因表达明显弱mdr1和Daudi组,降低60%左右,FCM检测Daudi/c的表达也获得相似结果。P-gP组和Daudi/Y/A0.03组对阿霉素、足叶乙甙、长春新碱和顺铂的IC50值均明显低Daudi/Y/A0.05(?)和Daudi/A0.03和Daudi/c/A0.03、Daudi/A0.05组Daudi/c/A0.05。Daudi/Y/A0.03和细胞内Daudi/Y/A0.05的浓度明显高于对照组,P均<0.05。6.在诱导性耐Rh123药的细胞中,核蛋白与Daudi启动子mdrl序列结合力随着阿霉素浓度的增Y-box加逐渐增加,和Daudi、Daudi/A0.01、Daudi/A0.03四组细胞核蛋白Daudi/A0.05均能与探针形成蛋白质-探针复合物,荧光强度分别为321.36、857.37、2167.52及3673.83；这一结合作用能被大剂量的未标记的特异性竞争探针及YB-1蛋白的抗体阻断,并呈剂量依赖性。7.染色质免疫沉淀实验进一步证实YB-1确实能结合于含序列的-181-+68位点Y-box启动子上,进而实现对mdr1基因表达的激mdr1活作用。8.酶切鉴定和DNA序列分析表明成功地构建了重组和突变pMDR-luc荧光素酶报告基因载体；pMDR-Ym-luc和Daudi/A0.03组细胞1Daudi/A0.05启ndr1动子活性明显增强,与组相比差异有显著性(P<0.05)。将Daudi突变的Y-box基因启动子荧光素酶重组载体mdrl转染pMDR-Ym-luc和Daudi细胞,三组诱Daudi/A导耐药细胞中相对荧光强度与对照组细胞相比,差异无显著性改变。Daudi检测显示,阿霉素作用于9.Western blotting细胞后ERK磷酸化增强,Daudi信号通路被激活。用MAPK/ERK抑制剂PD98059预处理MAPK细胞后能有Daudi效抑制阿霉素诱导ERK磷酸化,同时阿霉素所诱导的YB-1蛋白核易位也被明显抑制,但对YB-1基因转录和蛋白合成没有影响。检测显示,RT-PCR作PD98059用后阿霉素诱导的mdrl基因转录下降70%左右,FCM检测显示P-gp的表达也明显减少。结论：1.DLBCL中YB-1核阳性定位与pERK、P-gp的农达密切相关,YB-1核阳性高表达能引起细胞耐药,提示患者预后不良。2.阿霉素可以诱导Daudi细胞YB-1蛋白的表达,并促进其核易位,从而调控mdr1基因的表达,引起细胞耐药发生。YB-1基因沉默后mdr1诱导性表达减少。3.阿霉素诱导Daudi细胞耐药的形成与MAPK/ERK信号通路活化、核易位的YB-1与(?)ndr1基因启动子区Y-box序列结合活性增强以及mdr1启动子活性明显上调有关。