【摘 要】
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目的体外分离培养人多生牙来源根尖牙乳头牙细胞（apical papilla cells of human supernumerary teeth,APCs-S）与人多生牙来源牙髓细胞（dental pulp cells of human supernumerary teeth,DPCs-S）并对比二者生物学行为差异。构建无翼型MMTV整合位点家族成员5a（wingless-type MMTV in
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目的体外分离培养人多生牙来源根尖牙乳头牙细胞（apical papilla cells of human supernumerary teeth,APCs-S）与人多生牙来源牙髓细胞（dental pulp cells of human supernumerary teeth,DPCs-S）并对比二者生物学行为差异。构建无翼型MMTV整合位点家族成员5a（wingless-type MMTV integration site family member 5a,Wnt5a）慢病毒载体,并感染APCs-S,探讨Wnt5a基因修饰对APCs-S生物学行为的影响。方法1、采用酶消化法对APCs-S与DPCs-S进行体外分离培养;CCK-8法对两种细胞第1、3、5、7天的吸光光密度（optical density,OD）值进行检测;矿化诱导后对APCs-S和DPCs-S行茜素红染色,观察矿化结节数量;成脂诱导后对APCs-S和DPCs-S行油红O染色,观察脂滴数。2、利用Wnt5a慢病毒载体感染APCs-S,经嘌呤霉素筛选稳定株;采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,Real-time PCR）测定感染后APCs-S的Wnt5a的mRNA表达情况。感染后的APCs-S经成骨诱导培养,行碱性磷酸酶染色检测细胞的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）表达水平;感染后的APCs-S经茜素红染色观察细胞矿化结节数量;通过Real-time PCR测定成骨诱导后两组细胞成骨相关基因的mRNA表达情况。结果1、采用酶消化法可在体外成功分离培养APCs-S和DPCs-S,二者细胞形态较佳。茜素红染色与油红O染色结果显示两种细胞均具有成骨分化与成脂分化能力。APCs-S增殖和矿化结节形成能力显著高于DPCs-S。2、利用Wnt5a过表达慢病毒成功构建了稳定的Wnt5a过表达的APCs-S;Wnt5a过表达组的Wnt5a的mRNA相对表达量显著高于空载体对照组。ALP染色结果提示两组细胞均能表达ALP;茜素红染色结果显示Wnt5a过表达可促进APCs-S形成矿化结节;成骨诱导后,Wnt5a基因修饰APCs-S成骨相关基因ALP、Runt转录相关因子2（runt-related transcription factor 2,RUNX2）、骨涎蛋白（bone sialoprotein,BSP）的mRNA相对表达量均显著增加。结论1、从人多生牙分离培养得到的APCs-S和DPCs-S均具有良好的增殖能力及多向分化的潜能,APCs-S增殖能力和成骨分化能力优于DPCs-S,更适宜作为基因强化组织工程的种子细胞。2、Wnt5a慢病毒载体可成功感染APCs-S,并促进APCs-S高表达Wnt5a。Wnt5a基因修饰可促进APCs-S成骨分化。
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