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龙眼真菌性病害是造成采后贮藏期腐败的主要原因。龙眼焦腐病菌[Lasiodiplodia theobromae(Pat.)Griff.&Maubl]和龙眼拟茎点霉[Phomopsis longanae Chi.]是龙眼贮藏期的主要潜伏性真菌病原。本研究从海芋植物叶片中分离出的内生菌TNX-1对它们具有强烈的抑制作用。因此本论文对内生菌TNX-1进行了鉴定,并对它的发酵条件和抑菌物质的提取方法、理化特性及其作用机制进行了研究。结果如下:1、生防菌海芋内生菌的分离、鉴定:从海芋植物叶片中分离出一株对龙眼焦腐病菌具有强烈抑制作用的内生菌TNX-1,其菌落呈淡黄色,粗糙不透明,表面干燥,边缘不整齐,在液体培养基中培养表面形成薄膜。革兰氏阳性,菌体杆状,单个、成对或链状排列。芽孢椭圆形中生。该菌的形态及生理生化特征与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)和解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliqefaciens)的特征基本相似。其16S rDNA核苷酸序列与芽孢杆菌属同源达99%以上。在系统发育树中,菌株TNX-1与Bacillus amyloliquefaciens(HM989844)在一个分支中,可信度达99%。用枯草芽孢杆菌特异引物Bsu不能扩增出1300 bp的单一条带;用解淀粉芽孢杆菌特异引物Bam能扩增出1300 bp的单一条带;用Multiplex特异引物扩增出约736 bp的单一条带。因此鉴定其为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),并命名为Bacillus amyloliquefaciens TNX-1。2、生防菌海芋内生菌TNX-1(Bacillusamyloliquefaciens TNX-1)的发酵条件研究:分别以温度、碳源、氮源和初始pH为单因素初步筛选出较适合产生抑菌物质的发酵条件,然后设计并进行正交试验和验证试验,最后进行金属离子的添加优化,得到最适发酵条件为培养基配方:大豆粉3%、乙酸铵0.2%、K2HP04 0.1%、KC1 0.050%、MgSO4·7H2O 0.05%、FeS04 0.001%和甘露醇0.2%,不调pH;温度:32～35℃;接种量:5%;通气量:75mL/150mL;转速:170rpm;培养时间:76h。3、生防菌海芋内生菌TNX-1(Bacillus amyloliquefaciens TNX-1)发酵抑菌物质的分离方法研究:用有机溶剂沉淀、硫酸铵盐析、大孔树脂吸附和酸碱沉淀法对发酵液中的抑菌物质进行初步提取。研究表明,有机溶剂沉淀和大孔树脂吸附法提取效率较低,硫酸铵盐析法虽然得率较高,但成本也高。酸沉淀法具有经济快速得率高的特点,而且杂质较少。经过酸沉淀和甲醇抽提后,其溶液在199 nm处有最大吸收峰,初步表明该抑菌物质可能主要为脂肽类物质。4、生防菌海芋内生菌TNX-1(Bacillus amyloliquefaciens TNX-1)抑菌物质的理化特性:对TNX-1发酵抑菌产物的理化特性进行研究,结果表明,该抑菌物质对热较稳定,121℃下20 min仍保留部分活性;耐酸碱性,pH为2、4、10时,抑菌活性与对照无显著性差异,pH12时抑菌活性部分丧失,为对照的70.92%;耐紫外线,距紫外灯10 cm处照射30 min后的抑菌物质活性与对照无显著性差异;对蛋白酶稳定,在蛋白酶K及胰蛋白酶水浴中各处理5 h后抑菌活性基本保持不变。5、生防菌海芋内生菌TNX-1(Bacillusamyloliquefaciens TNX-1)抑菌机理初步研究:TNX-1与龙眼焦腐病原菌进行对峙培养,出现了明显的抑菌带。能导致病原菌菌丝体扭曲畸形,菌丝生长点产生大量泡囊,不能进一步发展成菌丝体,当浓度达到300 μg/mL时能完全抑制病原孢子的萌发。抑菌物质对龙眼焦腐病菌的纤维素酶和果胶酶等致病因子无显著影响。因此TNX-1的抑菌保鲜机理主要是其分泌的抑菌物质直接作用于病原菌,致使菌丝畸形,因而病害得到控制。