第一部分CDK5RAP2在乳腺癌中的差异表达目的：CDK5RAP2在中心体微管成核功能中具有重要的作用,该分子的突变将造成大脑发育障碍,即原发性小头畸形(MCPH)。该分子在增生性疾病(如肿瘤)中的作用尚无报导,为此我们将乳腺癌引入到CDK5RAP2的研究中,首先制备该分子的单克隆抗体,通过成对乳腺癌组织芯片检测其表达情况,为进一步探讨CDK5RAP2在肿瘤发生过程中的可能作用奠定基础。方法：应用甲基纤维素半固体培养基筛选杂交瘤细胞,并对单抗特异性进行鉴定。在30例成对乳腺浸润性导管癌组织芯片上,采用该抗体进行CDK5RAP2表达情况的初步检测。RT-PCR检测15例成对乳腺癌标本的该因子mRNA表达水平,通过Western blot检测6种乳腺癌细胞系中CDK5RAP2的表达。结果：1、细胞融合后,从甲基纤维素半固体培养基挑出788株克隆,ELISA检测筛选出22株阳性克隆,最终保留5株滴度高的单抗,选择DG10克隆进行腹水制备和抗体纯化。通过分段表达蛋白及CDK5RAP2敲除的细胞免疫荧光检测证明该单抗良好的特异性。2、30例成对标本组织芯片中,与癌旁正常组织相比,浸润性导管癌中CDK5RAP2表达升高有20例,阳性率约66.7%。RT-PCR检测mRNA的表达水平,15例中有11例癌组织的表达高于癌旁正常组织,阳性率约73.3%。Western blot检测在6种乳腺癌细胞(T47D、MDA-MB-435、MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-3、ADR) CDK5RAP2蛋白的表达,发现6种细胞均有不同程度的表达,而转移能力强的MDA-MB-435和MDA-MB-231细胞的表达高于其他细胞。结论：1、应用甲基纤维素半固体培养基筛选杂交瘤细胞,成功制备了CDK5RAP2单抗。实验表明应用该方法大大提高了克隆效率,为进一步研究奠定基础。2、CDK5RAP2在乳腺癌中表达升高,与癌旁正常乳腺组织有明显的差别,并且阳性率70%左右,表明该因子与乳腺癌的形成具有某种联系。结合前期CDK5RAP2体外功能实验结果进行推断：CDK5RAP2控制微管核化的功能可能促进肿瘤细胞的生长,在乳腺癌的进展中起到重要作用。第二部分CDK5RAP2在乳腺癌变过程中表达的变化目的：将癌前病变、导管原位癌引入到研究中,观察CDK5RAP2在乳腺癌从正常到癌变的各个阶段的表达变化。方法：选取正常乳腺组织及轻度增生(N)、癌前病变(Pre-Ca)、导管内癌(DCIS)和浸润性导管癌(IDC)石蜡包埋标本各30例,新鲜标本各15例,应用抗CDK5RAP2单克隆抗体进行免疫组织化学染色；从新鲜手术标本中提取RNA,采用荧光定量PCR的方法检测各组CDK5RAP2基因mRNA的表达,所得结果进行统计学分析。结果：1、免疫组化结果发现CDK5RAP2在癌前病变、DCIS及IDC组中均有表达,与正常乳腺组差异具有统计学意义,均P<0.001。三组CDK5RAP2高表达率分别为57%、73%、83%,呈现递增的趋势。2、荧光定量PCR结果显示IDC组CDK5RAP2的mRNA的表达比其他三组显著增高P<0.001；四组病例的表达亦呈递增的趋势,与免疫组化结果一致,癌前病变、DCIS及IDC的表达量分别是正常乳腺组的2.8、3.7和11.8倍。结论：1、CDK5RAP2在乳腺癌前病变、DCIS及IDC中均有表达,与正常乳腺组差异具有统计学意义,表明该因子在早期病变中即发挥作用,有可能成为乳腺癌早期诊断的标志物之一。2、CDK5RAP2在乳腺癌前病变、DCIS及IDC中的表达具有逐步递增的趋势,提示该因子对于乳腺癌的进展可能具有促进作用,对于研究乳腺癌发生进展的机制具有重要的提示作用。3、CDK5RAP2促进乳腺癌进展的可能机制为：细胞异常增生,伴随中心体异常,CDK5RAP2通过其微管成核作用,加速了异常细胞的分裂与传代,促使恶性细胞的不断累积,导致了乳腺从癌前病变的不典型增生到DCIS,最终发展为IDC的恶变进程。4、CDK5RAP2在乳腺癌中的高表达为建立“微管成核能力增强促进肿瘤进展”这一新理论提供了证据。第三部分CDK5RAP2的表达与乳腺癌临床病理因素相关性研究目的：进行CDK5RAP2大样本检测,通过临床病理资料的回顾性研究,分析其可能相关的临床病理指标。方法：采用具有10年随访的大样本乳腺癌病例的组织芯片,进行CDK5RAP2的免疫染色,分析其与临床病理参数的相关关系,绘制Kaplan-Meier生存曲线进行生存分析,Cox比例风险模型行单因素和多因素分析来评估影响肿瘤患者生存的预后因子。结果：1、大样本组织芯片检测CDK5RAP2阳性率为61.4%。CDK5RAP2蛋白表达与乳腺癌淋巴结转移密切相关(P=0.002),而与其他临床病理指标,如患者年龄,绝经状态,肿瘤组织学分级等不存在显著相关性。其中与肿瘤大小、PR的相关性处于临界值,分别为0.059和0.053。2、生存分析显示CDK5RAP2高表达对患者的无瘤生存及总体生存均有明显地影响,说明该因子与预后不良有关。通过单因素分析,发现肿瘤大小、淋巴结状态和CDK5RAP2表达与乳腺癌的复发及总体生存相关,可作为乳腺癌提示预后的指标。该样本又经多因素分析,发现与复发相关的因素仍旧是上述三个指标,与总体生存相关的因素只有淋巴结状态和CDK5RAP2表达,说明两者与乳腺癌的预后最为相关,可以独立或协同发挥作用。结论：1、CDK5RAP2蛋白表达与乳腺癌淋巴结转移密切相关,并与患者的肿瘤复发与预后不良有关。2、结合前两部分实验结果进行推断：在乳腺浸润性导管癌中,CDK5RAP2不仅仅是一种细胞生长促进剂,通过微管核化而促进肿瘤增殖,而且随着细胞恶性程度的增加,它又是一种细胞运动促进剂,由此体现在临床上CDK5RAP2阳性的患者发生淋巴结转移的比率增高,患者的预后生存不良。对于CDK5RAP2促进细胞运动的研究还有待深入进行。