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芍药（Paeonia lactifloraPall.）为芍药科芍药属花卉，是我国传统名花。但是，芍药与其它鲜切花一样，会随着花朵的开放迅速衰老。乙烯，作为一种植物激素，在植物生长和发育过程中起着重要作用，并调控花衰老。花朵乙烯水平的增加与花衰老相关。本研究克隆了芍药品种‘桃花飞雪’的乙烯受体基因家族成员、分析其表达水平并进行了 PlETR1基因的烟草遗传转化。另外，本研究开发了一种新的PCR技术：引物池-随机引物对PCR，使用该技术克隆到7个芍药泛素基因。研究结果如下： （1）通过RT-PCR获得芍药3条乙烯受体基因相关序列，结合本实验室在前期工作中借助RACE PCR技术获得的1条乙烯受体基因相关序列，生物信息学分析发现这4条非冗余序列编码的多肽链分别为拟南芥AtETR1、AtETR2、AtERS1和AtEIN4的同源序列，因而将这4个推测的基因命名为 PlETR1、PlETR2、PlERS1和PlEIN4。克隆获得的芍药PlETR1、PlETR2、PlERS1和PlEIN4DNA片段长度分别为2817bp、2286bp、2016bp和2295bp，依次编码740、761、633和764个氨基酸，核酸序列GenBank登录号为JX406435、KP265306、KP265307和KP265308。生物信息学分析表明PlETR1、PlETR2和PlERS1的N端3次跨膜，PlEIN4的N端4次跨膜。结构域分析显示这4个乙烯受体均具有GAF、HisKA和 HATPase_c3个典型的乙烯受体结构域，PlETR1、PlETR2和PlEIN4具有REC结构域，而PlERS1无此结构域。 以芍药花瓣不同发育时期表达最稳定的Actin2作为内参基因，采用实时荧光定量PCR技术分析这4个受体在芍药开花指数1～6级时的花瓣中的表达水平，结果表明：芍药乙烯受体的不同家族成员的表达模式和表达水平不同，PlETR1在1～5级花瓣中的表达模式呈“V”形，6级时仍然维持在较高水平；PlETR2在花瓣发育的6个阶段表达量都很低；PlERS1和PlEIN4在芍药花发育的6个阶段表达模式相似，在2级时的最低，6级时的最高，变化趋势都是从1级时的较高水平先下降后上升，再下降，随之上升到6级时的最高水平，整体的变化趋势近似“W”形。不同乙烯受体的差异表达模式表明芍药花瓣对乙烯具有复杂的响应机制。 （2）以cDNA为模板，扩增 PlETR1序列，将其连接到过表达载体pCambia1301-UbiN上并将重组载体导入农杆菌，采用叶盘法转化烟草。遗传转化的标记基因能够代谢潮霉素B，因而转基因成功的植株具有潮霉素B抗性。农杆菌侵染的烟草叶片接种到潮霉素选择培养基上，将烟草叶片愈伤组织分化形成的幼苗种在蛭石-草炭土基质中，幼苗长大后在DNA和RNA水平检测目的基因。本研究通过PCR确定PlETR1已经整合到烟草的基因组DNA上，并且借助RT-PCR确定PlETR1在烟草叶片中转录出RNA。 （3）IlluminaHiSeq?2000测序平台获得的Reads（直接测序获得的序列）较短，很难对高同源性多基因家族（如泛素基因家族）成员进行正确拼接。为了获得正确且完整的编码区序列（Coding sequence，CDS），可从转录组数据中分离含有5和3非编码区（Untranslated region，UTR）的同一基因家族成员相关序列，在UTR区分别设计上下游引物F（Forward primer）和R（Reverse primer），将所有F混合在一起构成F池，所有R构成R池。混合F池和R池组成总引物池，理论上通过一次PCR就能将PCR反应液中含有上下游引物的所有序列扩增出来，这样的PCR可被称为总引物池PCR（Totalprimed poolPCR，Total ppPCR）。做完总引物池PCR之后，将F池与R分别组合或R池与F分别组合，所执行的PCR分别被称为F池PCR（F-Pool PCR）和R池PCR（R-Pool PCR）。然后，将电泳后有条带的F池和R池PCR对应的R与F随机组合进行PCR（随机引物对PCR，Arbitrarily primedpair PCR，appPCR），再将扩增获得的条带回收并测序。引物池和随机引物对PCR合称为引物池-随机引物对PCR（Primed poolandarbitrarily primedpairs PCR，pp-appPCR），该技术适用于克隆已获得5和3 UTR序列并且无法通过拼接得到完整CDS的情况，用于分离高同源性多基因家族成员。 从芍药转录组数据中分离出12条含有5UTR和11条含有3UTR的泛素基因（Ubiquitin，UBQ）序列，在UTR区设计引物，可组合成1个总引物池、12个R池和11个F池。随机引物对PCR扩增出8条带，将测序后的序列命名为UBQ1-UBQ8，生物信息学分析测序结果表明：UBQ3和UBQ8为同一序列且UBQ1至UBQ7两两间非冗余，7条序列均为泛素基因，含有完整CDS，其GenBank登录号分别为KT203772.1、KP645374.1、KP708576.1、KP708577.1、KT203773.1、KP708578.1和KT203774.1。