研究背景与目的目前临床治疗中,碳青霉烯类抗生素的使用广泛。近年来,产超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum β-lactamases,ESBLs)和头孢菌素酶的细菌不断增加,碳青霉烯类抗生素被认为是治疗多重耐药菌的最后防线。但是,随着革兰阴性杆菌的广泛流行,碳青霉烯类抗生素大量使用,近年来出现了耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)感染的流行,并呈现逐年增多趋势,给临床带来巨大挑战。人源肠道一直是多重耐药菌、超级细菌和各种耐药基因的重要储存场所和感染来源。粪便标本培养被美国疾病预防控制中心推荐用来检测CRE和耐药基因,欧洲疾病预防控制中心建议采集粪便、直肠或肛周拭子进行CRE筛查,防止CRE院内传播。目前国内外学者主要对临床感染样本分离的CRE进行研究,对粪便携带的CRE调查较少,尚无对两者分离的CRE进行耐药机制及分子流行病学比较研究。并建立对四种常见肠杆菌科细菌的LAMP分子诊断方法,可以快速、简便。准确对其进行鉴定。研究方法1.研究样本的收集收集我院2014年7月至2016年6月送检的各类临床感染样本中分离的CRE。收集我院2014年7月至2015年6月共收集5000个住院患者入院常规检查的剩余粪便样本作为粪便调查样本,在终浓度为2mg/L美罗培南的麦康凯培养基上接种培养,筛选出耐碳青霉烯革兰阴性杆菌。2.菌株种属鉴定及药敏实验利用BD phoenix 100进行种属鉴定和药敏试验,筛选出最终确认为临床感染样本和粪便调查样本分离的CRE菌株。3.检测常见碳青霉烯酶基因PCR检测临床感染样本及粪便样本中分离的CRE的常见碳青霉烯酶基因NDM、VIM、IMP、KPC、OXA-48,将阳性PCR产物进行测序确认。4.检测常见ESBLs基因PCR检测临床感染样本及粪便样本中分离的CRE的常见ESBLs基因TEM、SHV和CTX-M,将阳性PCR产物进行测序确认。5.第Ⅰ类整合子及其基因盒检测检测第Ⅰ类整合酶基因,筛选出携带第Ⅰ类整合子的菌株,再进一步扩增其可变区,进行RFLP分析。6.ISCR及其基因盒检测检测ISCR1基因,筛选出携带ISCR1基因的菌株,再进一步扩增其可变区,进行RFLP分析。7.复杂性整合子及其基因盒检测对同时携带整合子和ISCR1的菌株扩增其串联区,以验证是否为复杂性第Ⅰ类整合子,并通过测序得到复杂性整合子的耐药基因盒排列类型。8.ERIC-PCR对于所有菌株进行ERIC-PCR基因分型及电泳图谱聚类分析,研究其克隆相关性。9.四种常见肠杆菌科细菌的LAMP检测方法的建立及评价针对四种肠杆菌科细菌特异性靶基因设计引物,分别为大肠埃希菌(uidA)、肺炎克雷伯菌(phoE)、阴沟肠杆菌(dnaJ)和产气肠杆菌(ThdF)。建立四种常见肠杆菌科细菌的LAMP检测方法,并对其敏感性和特异性进行临床评估。研究结果1.研究样本的收集从临床感染样本共分离出70株CRE,从5000份粪便调查样本中共筛查到65株CRE。2.碳青霉烯酶基因检测结果临床感染样本中常见碳青霉烯酶基因NDM、VIM、IMP、KPC检出率分别为12.9%。、2.9%、8.6%、7.1%;而粪便调查样本为 29.2%、6.2%、7.7%、1.5%。3.ESBLs基因检测结果临床感染样本中常见碳青霉烯酶基因TEM、SHV和CTX-M检出率分别为42.9%、28.6%、37.1%;而粪便调查样本为36.9%、23.1%、33.8%。4.Ⅰ类整合子及其基因盒检测结果在临床感染样本分离的70株CRE检测到50株(71.4%)整合酶Ⅰ基因扩增阳性,39株(78.0%)第Ⅰ类整合子可变区扩增阳性。而粪便调查样本分离的65株CRE检测到21株(32.3%%)整合酶Ⅰ基因扩增阳性,13株(61.9%)第Ⅰ类整合子可变区扩增阳性。5.ISCR1及其基因盒检测结果在临床感染样本分离的70株CRE检测到33株(47.1%)ISCR1扩增阳性,29株(87.9%)ISCR1可变区扩增阳性。而粪便调查样本分离的65株CRE检测到23株(35.4%)ISCR1扩增阳性,12株(52.22%)ISCR1可变区扩增阳性。6.复杂性整合子检测结果在临床感染样本分离的70株CRE检测到16株(22.9%)复杂性整合子扩增阳性。而粪便调查样本分离的65株CRE检测到7株(10.8%)复杂性整合子扩增阳性。7.ERIC-PCR基因分型及聚类分析在80%的相似水平,大肠埃希菌聚为29个类群,肺炎克雷伯菌聚为37个类群,阴沟肠杆菌聚为16个类群,产气肠杆菌聚为19个类群。将菌株资料、耐药相关基因及ERIC-PCR结果综合分析,我院分离出的CRE均为散发,无暴发流行。8.临床常见CRE的环介导恒温扩增检测方法的建立及评价在敏感性检测中,实时荧光法和直接观察法的最低检测限为10 copies/μ 1,在特异性检测中,仅对相应种属菌株呈阳性反应。结论1.本研究对135株临床感染样本和粪便调查样本检测常见碳青霉烯酶基因和ESBLs基因,发现他们两组样本在携带率之间有差异,NDM在粪便调查样本中携带率较高。2.本研究中第Ⅰ类整合子、ISCR1可变区和复杂性整合子分别检出10、5和2种不同类型的基因盒排列类型,携带23、10和10种不同类型耐药基因,主要包括氨基糖苷类耐药基因、氯霉素耐药基因、甲氧苄啶耐药基因、β-内酰胺酶基因、利福平耐药基因和喹诺酮耐药基因。3.ERIC-PCR基因分型及聚类分析,结合耐药基因研究结果阐明临床感染样本和粪便调查样本分离的CRE并非同一克隆源,我院分离出的CRE均为散发,无暴发流行。4.成功的建立了一种快速检测四种常见肠杆菌科细菌的LAMP方法,能对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和产气肠杆菌分别进行检测。