多发性骨髓瘤（MM）是一种终末分化浆细胞恶性肿瘤,是常见的成人血液系统恶性肿瘤。随着社会老龄化,其发病率一直在增加,而且有明显的年轻化趋势。尽管目前有效的联合化疗可使MM初治反应率达95%,但随后几乎100%复发并获得耐药。随着对MM研究的深入,MM驱动基因突变的识别为个体化治疗带来了巨大的希望,通过了解特定突变所导致的生物学行为改变及其机制,有助于针对此类患者制定个体化治疗方案。研究显示虽然MM的突变频率高,但缺乏普遍的驱动突变,这表明可能是关键途径的去调控而不是单个基因突变在MM中发挥了重要作用。此外,多个研究表明MM中这些突变的关键是MAPK途径的去调控。通过基于全外显子测序的前期研究,我们发现多个初治或复发MM患者的肿瘤细胞中存在KDR Q472H突变,KDR编码的VEGFR2蛋白是MAPK通路的上游蛋白之一;而且,多个研究发现KDR Q472H种系突变可增强肿瘤组织的微血管密度且与不良预后相关。由此我们推测KDR Q472H突变可能对MM的生物学行为产生影响。为了探究多发性骨髓瘤肿瘤细胞中KDR Q472H突变可能产生的意义及其机制,我们进行了以下2部分的研究:第一部分多发性骨髓瘤肿瘤细胞中KDR Q472H突变的意义目的:明确多发性骨髓瘤肿瘤细胞中KDR Q472H突变的意义方法:1.构建KDR野生型及KDR Q472H真核表达质粒;2.通过慢病毒转染的方式构建VEGFR2野生型及VEGFR2 Q472H稳转细胞系;3.通过Western blot检测两种细胞中相关蛋白的表达情况;4.通过流式细胞仪检测不同药物处理后两种细胞的凋亡情况;5.通过动物实验验证体外实验的结果。结果:1.成功构建KDR野生型及KDR Q472H真核表达质粒,经测序验证基因序列正确;2.通过荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞转染效率达90%以上,通过Western blot检测两种质粒均可在OPM2细胞中稳定表达VEGFR2蛋白;3.KDR Q472H突变骨髓瘤细胞中磷酸化VEGFR2及磷酸化p44/42 MAPK蛋白水平增高;4.在体外实验中KDR Q472H突变增强了MM细胞对蛋白酶体抑制剂的耐药;卡非佐米或伊沙佐米联合MEK1/2抑制剂可以在一定程度上逆转KDR Q472H突变导致的MM细胞耐药;5.在动物实验中证明携带KDR Q472H突变的肿瘤对蛋白酶体抑制剂治疗的反应较差;结论:KDR Q472H突变可导致骨髓瘤细胞对蛋白酶体抑制剂耐药,且不能被VEGFR2抑制剂克服;卡非佐米或伊沙佐米联合MEK1/2抑制剂可以在一定程度上逆转耐药。第二部分KDR Q472H突变导致多发性骨髓瘤耐药的机制研究目的:对KDR Q472H突变导致多发性骨髓瘤耐药机制的探究方法:1.在转录组水平对构建的KDR野生型及KDR Q472H稳转细胞进行测序比较,通过Western blot检测在蛋白水平验证;2.通过sh RNA敲低KDR Q472H突变骨髓瘤细胞中AIM2的表达,通过流式细胞仪检测骨髓瘤细胞对蛋白酶体抑制剂及MEK1/2抑制剂处理后的凋亡变化;3.通过Western blot检测敲低AIM2后骨髓瘤细胞中相关蛋白表达的变化;4.通过RT-q PCR检测MEK1/2抑制剂处理后AIM2 m RNA水平的变化;5.通过流式细胞仪检测VX-765处理后骨髓瘤细胞的凋亡变化.6.通过Western blot检测在小鼠皮下移植瘤组织中验证相关蛋白表达情况。结果:1.骨髓瘤细胞中KDR Q472H突变可在转录水平上调AIM2的表达;2.在KDR Q472H突变骨髓瘤细胞中敲低AIM2可逆转对蛋白酶体抑制剂及MEK1/2抑制剂的耐药;3.在KDR Q472H突变骨髓瘤细胞中敲低AIM2可导致磷酸化p44/42 MAPK水平降低;KDR Q472H突变骨髓瘤细胞耐药是AIM2-MAPK通路依赖的;4.MEK1/2与AIM2之间可能存在相互调节关系;5.KDR Q472H突变上调AIM2导致骨髓瘤细胞耐药与炎症小体通路无关;6.小鼠皮下移植瘤组织中AIM2,磷酸化p44/42 MAPK的表达变化与体外实验一致。结论:KDR Q472H突变通过上调AIM2-MAPK通路介导骨髓瘤细胞耐药,且与炎症小体通路无关;AIM2的表达在转录水平受到调控。