【摘 要】
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目的:构建人中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂Elafin(elastase-specific inhibitor)重组载体,探讨其转染表达对气道上皮完整性维护的分子机制,为将重组Elafin用于临床治疗气道慢性
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目的:构建人中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂Elafin(elastase-specific inhibitor)重组载体,探讨其转染表达对气道上皮完整性维护的分子机制,为将重组Elafin用于临床治疗气道慢性气道炎症性疾病提供理论和实验基础。方法:(1)抽提人肺总RNA进行逆转录反应,经PCR扩增目的基因片段,将其克隆于绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达载体pEGFP-C1上,经酶切电泳、DNA测序鉴定分析构建是否成功。(2)将构建的重组质粒pEGFP-C1-Elafin转染入A549细胞,将其与多形核粒细胞(polymorphonuclear granulocyte,PMN)共孵育,经脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激24h后,用Western bolt检测细胞中紧密连接相关蛋白zonula occludens-1(ZO-1)表达、MTT法测定细胞与胶原附着能力、底物法测定培养上清中中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)的活性及ELISA检测上清中Elafin的水平。1结果:(1)经PCR获得459bp的产物,经酶切、DNA测序,确定所扩增片段为人Elafin基因cDNA,进而成功筛选出表达载体pEGFP-C1-Elafin,
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