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目的:评价RNA干扰技术对人胰腺癌ASCP1、BXPC3、PAN-C细胞系中谷氨酰胺转运体ASCT2表达的阻断效应,于体外细胞培养及裸鼠在体实验两个水平检测ASCT2基因沉默后胰腺癌细胞的增殖、凋亡等生物学特征的改变,并探索其相关的分子机制。方法:1.胰腺癌细胞株ASPC1、BXPC3、PAN-C作为体外细胞模型,待细胞生长密度至70%~80%时以每孔10~5个细胞接种2个6孔板中,分别以含2mM谷氨酰胺(glutamine,Gln)DMEM培养基和不含Gln的DMEM培养基中培养,并于第1、3、5、7天收集细胞,采用细胞记数仪检测细胞数目,并绘制细胞生长曲线。2.待细胞生长密度至70%~80%时,以每皿铺800个细胞接种于35mm培养皿中,待培养12hr后完全贴壁更换不含谷氨酰胺培养基,对照组培养基中添加2mm谷氨酰胺。培养两周后,采用结晶紫染色检测细胞克隆形成情况。3.构建靶向ASCT2基因的短发夹状RNA(shRNA)慢病毒表达载体,与慢病毒包装三质粒系统pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2.G转染293T细胞并包装出慢病毒,用慢病毒感染胰腺癌细胞株24hr,嘌呤霉素筛选72hr后,通过采用实时荧光定量PCR法和蛋白免疫印迹法检测ASCT2的表达,采用Biovision公司的细胞代谢检测试剂盒检测ASCT2基因沉默的胰腺癌细胞株中ATP、ɑ-酮戊二酸(ɑ-KG)以及培养基上清中谷氨酰胺的含量。4.构建ASCT2基因沉默稳定的胰腺癌细胞株,以阴性NC shRNA作为对照组,采用细胞计数仪检测细胞培养第1、3、5、7天的细胞数目,绘制两组的生长曲线;5.采用流式细胞术检测细胞凋亡率,分析细胞周期分布;采用蛋白免疫印迹法测定ASCT2基因沉默后p AKT、p70S6K、p4E-BP1、Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase3蛋白表达量的变化;6.采用裸鼠移植瘤模型,测量瘤重变化,比较肿瘤体积生长曲线,通过蛋白免疫印迹法检测肿瘤组织中ASCT2和Cleaved-Caspase3的表达量的变化。结果:1.细胞生长曲线结果:连续培养7天后,三种胰腺癌细胞株的谷氨酰胺缺失组的细胞生长明显减慢,而其对照组的细胞均于培养3天后呈指数增长。2.细胞克隆实验结果:谷氨酰胺缺失组ASPC1、BXPC3细胞生长抑制明显,克隆团数量及体积均较正常培养基组明显减小,而谷氨酰胺缺失组PAN-C细胞克隆团形成很少。3.ASCT2基因沉默效率:细胞株嘌呤筛选72hr后,RT PCR法与Western blot检测显示ASCT2的m RNA和蛋白表达水平明显下降,其抑制效率均大于90%。4.沉默三株细胞的ASCT2基因,谷氨酰胺的摄取率均下降50%以上,细胞体内ATP、ɑ-KG水平明显下降;5.ASCT2基因沉默对生长曲线的影响:连续培养7天后,ASCT基因沉默组细胞的生长明显减慢,其中PAN-C细胞株的谷氨酰胺缺失组细胞生长抑制最明显,而对照组细胞均于培养48hr后呈指数增长;6.ASCT2基因沉默对细胞周期与凋亡的影响:流式细胞仪检测结果显示,与对照组相比,BXPC3细胞在细胞周期G1期前出现"亚二倍体"凋亡峰(subG2峰),G2期细胞明显增多,G1期细胞减少,S期细胞的比例变化不明显,提示细胞周期明显阻滞于G2/M期;PAN-C细胞在S期细胞减少,G1及G2期细胞增加,提示细胞周期阻滞于G1/S期;ASPC-1细胞周期在G1期前出现subG2峰,S期细胞明显减少,G2期细胞明显升高,G1期细胞的比例变化不明显,提示细胞周期阻滞于G2期。细胞凋亡结果显示沉默ASCT2基因后,其凋亡率均明显上升。蛋白免疫印迹结果显示沉默ASCT2基因后,其凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3、Bax比例明显上调,而抗凋亡相关蛋白Bcl-2的比例则明显下降。7.ASCT2基因沉默对Akt/mTOR通路的影响:对照组在加入胰岛素后,其p-Akt、p-S6k、p-4EBP1的相对表达量均明显升高,而ASCT2基因沉默后,胰岛素诱导的p-Akt、p-S6k、p-4EBP1蛋白表达升高水平均明显下降,表明ASCT2在Akt/mTOR通路信号通路的激活过程中发挥重要作用。8.ASCT2基因沉默对BXPC3裸鼠移植瘤的影响:通过肿瘤体积生长曲线可以发现:shASCT2组肿瘤生长体积速率明显小于对照组(p<0.01);裸鼠处死后测定肿瘤质量,结果示:shASCT2组肿瘤质量明显小于Control组(p<0.01),表明ASCT2基因沉默后,胰腺癌瘤体生长明显减慢。蛋白免疫印迹结果显示,与对照组相比,ASCT2基因沉默组肿瘤组织中的ASCT2蛋白表达量明显下降(p<0.01),Cleaved-Caspase3表达明显升高(p<0.01),表明ASCT2沉默后通过促使细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的体内成瘤能力。结论:1.胰腺癌细胞ASPC1、BXPC3、PAN-C的生长和存活依赖谷氨酰胺,ASCT2参与该胰腺癌细胞的谷氨酰胺代谢。2.ASCT2沉默与化学性抑制可有效抑制胰腺癌细胞ASPC1、PAN-C、BXPC3的生长增殖;3.ASCT2沉默对胰腺癌细胞ASPC1、BXPC3、PAN-C的抑制作用可能与影响细胞周期及诱导细胞凋亡有关;4.ASCT2沉默对胰腺癌细胞ASPC1、BXPC3、PAN-C的抑制作用可能与ASCT2抑制Akt/m TOR通路信号通路的激活有关;5.ASCT2沉默对胰腺癌裸鼠移植瘤的增殖具有明显抑制作用,表明ASCT2功能缺失能抑制体内肿瘤的发生。我们的研究结果表明,ASCT2可作为胰腺癌治疗的潜在靶点。