背景与目的白血病(Leukemial)是由于造血干细胞不受机体基因调控,从而恶性克隆所形成的疾病,这些恶性克隆细胞大量增生累积,抑制正常造血细胞,同时广泛浸润肝、脾、淋巴结等各种脏器。白血病细胞自我更新增强、增殖失控、分化障碍及凋亡受阻,从而停滞在细胞发育的不同阶段。临床表现为贫血(通常为正细胞正色素性贫血)、出血(血小板低下)、感染(粒细胞缺乏)和浸润(通常受累脾、淋巴结)等征象。根据恶性增殖的细胞系大致可将AL分为急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia1)和急性髓系细胞白血病(Acute myeloid Leukemia1)。根据增殖的白血病细胞免疫表型,ALL又可分为B细胞型、T细胞型和T/B混合型。其中T细胞型ALL(T-ALL)是以T细胞增殖失控,大量分化障碍的T细胞恶性克隆性增生、积聚,从而大量T细胞浸润组织为特征的血液系统恶性疾病,占ALL的15%-25%,有别于B细胞型ALL,它具有独特的临床表现、细胞遗传学、免疫学和分子生物学等特点。T-ALL患者预后相对其他类型白血病差,特别是一些患儿。随着医学的发展,多种抗肿瘤药联合化疗的方案及大剂量化疗的临床应用,使得T-ALL患者预后有了很大改善,但仍有部分患者即使大剂量化疗也不能达到完全缓解,T-ALL难治性问题是血液科临床医师面临的最大挑战。所以说,T-ALL的治疗仍是目前白血病治疗的难点和重点。地西他滨(Decitabine,DAC)作为新型抗肿瘤药物,属于DNA甲基化转移酶抑制剂,其研究发现,DAC本身也是去甲基化药物,且具有酶的特异性。目前研究热点多集中于DAC在白血病中发挥的去甲基化作用,从而达到治疗目标,国外最新研究发现,DAC亦能参与多种信号传导路径活化过程,如JAK-STAT,表明可能通过其他途径发挥其促进细胞凋亡的作用,但关DAC促凋亡的研究,国内外甚少。TAL1(T cell acute lymphoblastic leukemia1)基因位于染色体的1p32,它对调控造血干细胞的发育以及各系血细胞的分化形成起着至关重要的作用。TAL1基因是急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)患者中最常见的染色体重排靶标,越来越多的研究支持TAL1基因在白血病的发病过程中扮演者不可或缺的角色。尽管TAL1基因最初是在发生了染色体易位的T-ALL病人中发现,但随后研究表明,其在正常血细胞分化过程中担任了不可或缺的角色。动物实验研究表明,TAL1的发育起始于老鼠胚胎的8.5天,随后在上皮组织及神经组织中表达,在红系及巨噬系细胞中也有表达;研究人员在敲除了TAL1基因后,老鼠均在9.5天左右死亡,同时发现缺失TAL1基因的老鼠,造血组织受到了不可恢复的影响,均停滞发育、分化,从而造成小鼠死亡。临床研究表明,多于60%的T-ALL病人中,TAL1表达水平是升高的,提示它对肿瘤的发生和进展起重要作用。然而,是什么原因导致了TAL1的高表达,至今仍未清楚。本实验选择不同浓度的DAC作用于白血病Jurkat细胞系,观察其对Jurkat细胞系的增殖、凋亡及对TAL1基因表达的影响。为DAC治疗T-ALL提供实验室依据。材料与方法1.WST-1测细胞增值率:采用终浓度为0.5、1、5、10μmol/L的DAC作用于Jurkat细胞24h、48、72h,确定地西他滨作用于细胞的适宜浓度与时间。2.观察细胞形态学变化:以0μmol/L及5μmol/L DAC作用于Jurkat细胞48h,荧光倒置显微镜下观察。3.通过Real-time RT-PCR实验方法分析检测检测实验组Jurkat细胞及空白对照组TAL1m RNA表达。4.流式细胞术检测细胞凋亡:5μmol/L DAC作用于Jurkat细胞48h后,用Annexin V-FITC/PI双染色法通过流式细胞仪检测细胞凋亡。结果1.WST-1结果显示:不同浓度的DAC对Jurkat细胞的增殖均具有明显的抑制作用。DAC终浓度为0.5、1、5、10μmol/L,作用于Jurkat细胞24h,对Jurkat细胞增殖均有抑制作用,其抑制率分别为(13.8±1.15)%、(25.8±0.93)%、(41.6±2.01)%、(49.5±0.48)%;各浓度组与空白对照组(1.70±0.25)%比较,其差异有统计学意义(P<0.05);不同浓度组间两两比较,差异有统计学意义(P<0.05)。DAC5μmol/L作用于Jurkat细胞24、48、72h,对Jurkat细胞生长有明显抑制作用,抑制率分别为(41.6±2.01)%、(55.8±1.22)%和(59.6±2.13)%,组间两两比较,24h与48h组差异有统计学意义(P<0.05);48h与72h组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。由此计算出地西他滨处理Jurkat细胞的半数抑制浓度(IC50值)接近于5μmol/L因此选择其为实验组进行后续试验。2.观察细胞形态学变化:根据WST-1实验得出DAC最佳作用时间及IC50值,以0μmol/L及5μmol/L DAC作用于Jurkat细胞48h,荧光倒置显微镜下观察,5μmol/L实验组较0μmol/L对照组细胞核明显出现变形、浓缩、肾形核及花瓣样改变,说明DAC诱导Jurkat细胞凋亡。3.通过实时荧光定量PCR法分析检测出实验组Jurkat细胞系中TAL1m RNA表达水平明显降低(0.375±0.0156),与对照组相比较(1.038±0.049),差异有显著统计学意义(P=0.002;t=12.92)。4.流式细胞术检测细胞凋亡:Annexin V和PI双染流式细胞术检测细胞凋亡结果表明,5μmol/L DAC,作用于Jurkat细胞48h后,其细胞凋亡率分别为(63.5±1.6)%,高于对照组(7.4±0.8)%(P<0.05),其差异有统计学意义。结论地西他滨能抑制Jurkat细胞的增殖及诱导凋亡,显著下调TAL1m RNA表达。