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DNA磷硫酰化修饰是一种发生在DNA双螺旋骨架上的一种修饰,通过将硫原子替代了骨架上非桥连的氧原子而得到。DNA磷硫酰化修饰的发现是由于在体外操作具有磷硫酰化修饰的DNA进行琼脂糖凝胶电泳时,DNA条带发生弥散所致,通过数十年的研究,目前确定了 DNA磷硫酰化修饰是由dnd基因簇所赋予的,其中dnd基因簇分为两大部分,起到修饰作用的dndACDE,以及起到限制作用的dndFGHI,可能参与到了维持宿主遗传信息稳定性,抵御外来基因入侵,同时磷硫酰化修饰后的DNA具有更好的抗氧化能力。由于DNA磷硫酰化修饰能赋予宿主一定的抗逆性,因而在原核生物中具有广泛的分布,并且彼此没有的明显亲缘关系且栖息环境相差甚远。因此推测dnd基因簇有可能是通过水平基因转移的方式进行的传播。古生菌作为“三域生命”中重要的一域,同时也属于原核生物。之前通过在古生菌中搜索dnd基因簇并进行序列比对,我们同样发现了在古生菌中也有dnd基因簇的分布,暗示着古生菌中同样可能存在着DNA磷硫酰化修饰。古生菌被认为地球上进化最为缓慢的细胞生命,这对于我们研究DNA磷硫酰化修饰与原核生物进化过程有着重要的意义。通过实验室先前的工作,我们在耐盐陆生古菌HaloterrigenajeotgaliA29、班戈错湖嗜盐碱红菌Natronorubrumbangense JCM 10635和嗜酸产甲烷古菌Methanoregulaboonei 6A8这三株古生菌中运用LC-MS检测手段对其中可能存在的DNA磷硫酰化修饰类型做了检测,并确实发现了DNA磷硫酰化修饰的存在。本课题继续利用LC-MS检测手段对极端嗜盐古生菌Halapricum salinum JCM 19729中的DNA磷硫酰化修饰的位点进行了测定,发现了在HsalinumJCM 19729中存在d(GpsA)Rp形式的修饰,并对修饰水平进行了精确定量。与此同时,利用最新的单分子实时测序技术——SMRT测序技术,我们对Htg.jeotgaliA29以及Nrrbangens.JCM 10635这两株古生菌进行了三代测序,通过SMRT测序,我们确定了这两株古生菌DNA磷硫酰化修饰在基因组上的精确分布,并且结合体外甲基化检测甲基化修饰-磷硫酰化修饰双修饰的手段,确定了这两株古生菌的磷硫酰化修饰的核心序列都是5’-GpSATC-3’,同时本研究还致力于探究古生菌之间以及古生菌-细菌之间的DNA磷硫酰化修饰系统的水平基因转移,通过将Htg.jeotgali A29的dnd基因簇dndCDEA导入到另一株不具备dnd基因簇的极端嗜盐古生菌Natrinemasp.CJ7中进行异源表达,发现在导入dnd基因簇以后,会赋予宿主CJ7以DNAPT修饰,第一次在古生菌中完成了dnd基因簇的异源表达。从侧面体现了在古生菌域中同样存在类似细菌中的dnd基因簇的水平基因转移的可能性。在此基础上,通过改造质粒,对古生菌中dnd基因簇进行了精简,发现古生菌A29 dnd基因簇仅需要dndCDE就可以赋予宿主DNA PT修饰。并且对导入dnd基因簇的CJ7宿主同样进行了 LC-MS的定量,发现同样存在d(GpsA)p形式的修饰,与来源菌株Htg.jeotgaliA29 一致。此外,本课题还对古生菌dnd基因簇在大肠杆菌中的异源表达、古生菌限制相关DndR蛋白的功能分析以及含磷硫酰化修饰古生菌敲除系统的构建进行了初步探索,为磷硫酰化修饰-限制系统的研究提供了更丰富的研究对象,同时也为解析磷硫酰化修饰-限制系统的起源、进化过程、分化动力、对全局基因表达、生命活动的影响及生理意义提供了一个新的方向。