猪链球菌病是一种重要的人兽共患传染病,能导致仔猪脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎和人的脑膜炎,对公共卫生尤其是相应从业人员的生命安全构成威胁。因抗生素滥用,导致细菌耐药,给该病的防控带来了困难。由噬菌体基因编码的裂解酶——裂解效率高、与抗生素具协同作用,且不易产生抗性菌株,是一种颇具潜力的杀菌制剂。本文通过重组表达的方法获得纯化的猪链球菌噬菌体裂解酶LySMP,研究了该酶的杀菌作用特点、酶不同结构区域Lys1、Lys2、Lys3和Lys4的杀菌活性以及应用裂解酶全酶治疗感染猪链球菌的斑马鱼的保护作用。为了获得具有生物学活性的猪链球菌噬菌体裂解酶LySMP,采用重组表达技术,PCR扩增噬菌体SMP的裂解酶基因,插入pET-28a(+)中,构建出重组表达载体pET-lys。将该载体导入大肠杆菌BL21中诱导表达,获得55kDa的融合LySMP蛋白。酶谱试验表明该蛋白具有裂解宿主菌SS2-H的活性。表达产物经纯化后,浓度可达1-3mg/ml。裂解酶LySMP的体外生物学活性的研究发现纯化的LySMP需加0.8%β-巯基乙醇方可发挥裂解作用。同时,细菌用PMSF和溶菌酶处理后也具有更好的裂解效果。平板裂解试验结果显示,LySMP的超声破碎粗提物裂解谱比原始噬菌体广。噬菌体的宿主菌仅有2株猪链球菌2型,但在17株猪链球菌2型中,有15株可被裂解酶裂解,此外,所测的猪链球菌7型、9型,马兽疫链球菌亚种以及金黄色葡萄球菌,也可被裂解,不过目前尚未发现其可裂解大肠杆菌和沙门氏菌。LySMP在37℃,pH5.2的条件下,裂解效率最高。LySMP可使所测细菌浊度下降约1.2-98%不等。为了进一步研究LySMP发挥裂解功能的区域,并比较各功能区与全酶的裂解效率,同样通过大肠杆菌原核表达技术,针对全酶LySMP上的催化区和结合区,进行了四种不同组合的区域表达。各片段位于LySMP 1-243、1-279、2-300和151-443位氨基酸,表达产物命名为Ly1, Lys2,Lys3,Lys4。表达后产物大小分别为32kDa、36kDa、39kDa和37kDa。酶谱试验显示,Lys1和Lys2蛋白具有裂解宿主菌SS2-H的活性。而Lys3和Lys4未形成可见的透明条带。表达产物Lys1, Lys2经纯化后,浓度可达1-3mg/ml。对有较强裂解活性的区段Lys1和Lys2进行了体外生物学活性测定和条件优化。超声波处理的Lys1, Lys2粗提物的裂解谱均比原始噬菌体广,但比全酶LySMP的裂解谱窄。在17株猪链球菌2型中,7株可被Lys1和Lys2分别裂解,金黄色葡萄球菌也可被裂解,形成透明的抑菌圈。7型菌株、9型菌株、马兽疫链球菌亚种、大肠杆菌和沙门氏菌均不被裂解,不形成抑菌圈。Lys1中加入0.3%β-巯基乙醇或加入20mM半胱氨酸后酶活性最高;而Lys2中则需加入0.8%β-巯基乙醇或加入15mM半胱氨酸方可使酶活性达到最高。Lys1和Lys2的最佳作用温度均为37℃,Lys1和Lys2分别在pH5.2和pH 6.8的条件下裂解效率最高。浓度均为100mM的Lys1、Lys2和LySMP对SS2-4菌株的裂解试验结果显示,LySMP使细菌浊度下降最多,达到33.7%;其次是Lys2,下降27.2%;Lys1最低,只有8.9%。为了研究裂解酶的体内抗菌效果,选用裂解活性较强的LySMP,以斑马鱼作为模式动物,统计裂解酶处理组和细菌攻击对照组斑马鱼的存活率,从而揭示裂解酶的体内抗感染效果。试验研究了LySMP在不同感染阶段对猪链球菌HA9801的抗感染效果。将斑马鱼分为7组,每组30尾。裂解酶处理组1为在50LD50猪链球菌HA9801攻击前30min,用2μg LySMP腹腔注射斑马鱼;裂解酶处理组2为用50LD50的猪链球菌HA9801与2μg lySMP的混合物(1:1)腹腔注射斑马鱼;裂解酶处理组3为在50LD50猪链球菌HA9801攻击30min后,用2μg LySMP腹腔注射斑马鱼;抗生素处理组用2μg阿莫西林,于50LD50猪链球菌HA9801攻击后30min腹腔注射斑马鱼,计算各组斑马鱼的存活率。同时设猪链球菌HA9801攻击对照组、PBS对照组、LySMP对照组。结果表明,裂解酶处理组1、2、3均对猪链球菌有抗感染作用,斑马鱼的存活率分别可达70%、66.7%和70%,而HA9801攻击组存活率仅有6.7%。抗生素治疗组存活率可达96.7%,PBS对照组、LySMP对照组存活率均为100%,表明裂解酶对斑马鱼具有抗感染效果。为了评估LySMP对猪链球菌不同血清型、不同菌株的体内抗菌活性,选用猪链球菌2型SS2-H、SS2-3、猪链球菌9型SH040817和猪链球菌7型SH040805作为攻击菌株,分别腹腔注射斑马鱼各30尾,30min后再注射2μg LySMP,计算斑马鱼的存活率。结果显示,LySMP注射后能有效抵御猪链球菌SS2-H、SS2-3、SH040817及SH040805的攻击,存活率分别达到90%、93.3%、86.7%及60%。LySMP对SS2-H、SS2-3、SH040805有较强的抗感染效果,与攻击对照组相比,存活率分别提高了36.7%、66.6%、40%。斑马鱼感染猪链球菌后通过注射LySMP可显著提高存活率的事实提示,LySMP可作为防控猪链球菌病的一种高效抗感染制剂。猪链球菌烈性噬菌体SMP宿主谱很窄,仅可感染猪链球菌SS2-H和SS2-6形成噬斑,因而制约了噬菌体在防控猪链球菌上的应用。为了阐明噬菌体与猪链球菌相互作用的物质基础,本研究通过化学和酶法以及原生质体吸附等方法确定了噬菌体在猪链球菌上的受体成分。通过提取细菌细胞壁,将细胞壁稀释后用蛋白酶K、SDS、变溶菌素处理的方法,分别破坏蛋白或多糖成分,再与噬菌体共孵育,发现采用变溶菌素处理的细胞壁可使噬菌体的吸附率降低至23.1%;制备SS2-H原生质体,作原生质球吸附试验,结果显示噬菌体对原生质体吸附率为0。分别用甘露糖、半乳糖、核糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖等组成噬菌体磷壁酸的成分进行结合阻断试验,结果表明,甘露糖、鼠李糖、氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖对SMP分别有32.3%、41.9%、50%和25.8%的阻断作用。在可逆性吸附试验中,分别在30min、60min和90min时,检测噬菌体对细胞壁的吸附率,结果呈现不可逆吸附,在90min时即达到完全吸附。上述结果表明,参与噬菌体SMP受体结合的细菌成分为多糖,极有可能为肽聚糖或磷壁酸,蛋白质未参与其吸附作用。SMP识别细菌细胞表面的氨基葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖及鼠李糖成分,而葡萄糖和半乳糖不参与噬菌体识别,噬菌体对受体的识别是不可逆的。