论文部分内容阅读
水产品药物的残留给人类健康和环境带来了很大的危害。而药物在生物体内的转化离不开药物代谢酶的参与，其活性的诱导或抑制会导致药物的相互作用，从而影响药物的残留或影响药效。已有研究表明生物体内重要的药物代谢酶有一相代谢酶细胞色素P450酶系（CYP450s）和二相代谢酶谷胱甘肽S-转移酶系（GSTs）。然而，关于海洋甲壳动物中药物代谢酶相关基因以及水产药物对其表达水平和酶活性影响的研究却非常少。本文以此为切入点，以我国重要的养殖蟹类-三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）为研究对象，研究磺胺二甲嘧啶SM2、磺胺嘧啶SD和磺胺间甲氧嘧啶SMM等短、中、长三种磺胺类药物对CYP2和GST基因表达以及酶活性的影响。为研究海洋甲壳动物药物代谢酶基因的功能提供基础数据，同时为磺胺类药物在水产上的安全使用提供技术支持。本论文主要研究内容共分为以下三部分：第一部分：以三疣梭子蟹“黄选1号”为研究对象，通过简并引物扩增及SMARTTMRACE扩增获得三疣梭子蟹细胞色素P450（CYP2）基因cDNA全长为1662bp（GenBank登录号：KF781516），包含1479bp的开放阅读框（ORF），编码一个由492个氨基酸组成的多肽，预测理论等电点PI为6.348，分子量大小为56.68kDa。氨基酸序列中含有CYP基因家族特有的K螺旋保守序列（ExxR）和血红素结合区（FxxGxxxCxG）。同源性及系统进化分析表明，三疣梭子蟹CYP2基因与岸蟹（Carcinus maenas）和佛罗里达龙虾（Panulirus argus）的同源性分别为75%和39%。荧光定量RT-PCR结果表明，CYP2基因在肝胰腺、鳃、心脏、肌肉、眼柄和血淋巴中都有表达。在肝胰腺中表达量最高（P<0.01），其次是鳃（P<0.01），在血淋巴中表达最少。本实验用SM2、SD和SMM三种不同浓度磺胺药物刺激三疣梭子蟹CYP2基因的表达，发现此三种磺胺药物在CYP2mRNA转录水平上有影响，均可诱导肝胰腺中CYP2基因的表达。在SM2各剂量组对CYP2基因的表达量不太显著，只在高浓度组对其有显著诱导效应（P<0.05）。SD和SMM各剂量组对CYP2基因的表达量有极显著诱导效应（P<0.01），并且在SD各剂量组随给药剂量越大，CYP2基因上调水平越高，且出现的峰值越晚。结果表明，三种磺胺药物可使CYP2表达量升高，说明其对CYP2有诱导作用，揭示了磺胺药物与CYP2酶的底物药物合用时，很可能会发生药物的相互作用，应适当调整用量，避免使药物达不到疗效。第二部分，克隆了三疣梭子蟹谷胱甘肽S-转移酶（GST）基因cDNA全长序列（登录号：KF781517）。该基因全长1010bp，包含651bp的开放阅读框（ORF），编码一个由216个氨基酸组成的多肽，预测理论等电点PI为5.294，分子量大小为24.59kDa。氨基酸序列中含有GST基因家族特有GST-N结构域和GST-C结构域。同源性及系统进化分析表明，三疣梭子蟹GST基因与中华绒螯蟹（Eriocheir sinesis）和脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）的同源性分别为78%和63%。荧光定量RT-PCR结果表明，GST在肝胰腺、鳃、心脏、肌肉、眼柄和血淋巴中都有表达，在肝胰腺中表达量最高（P<0.01），其次是鳃（P<0.01），在心脏中表达最少。本实验用SM2、SD和SMM三种不同浓度磺胺药物刺激三疣梭子蟹GST基因的表达，发现此三种磺胺药物在GSTmRNA转录水平上有影响，且呈现时间效应。在实验的1、3、6h均呈现先小幅度升高（P<0.01），这表明在外源药物的刺激下生物体表现出一定的诱导作用，说明此诱导使生物体的解毒能力增加。随着时间的延长在12和18h呈现下降趋势（P<0.01），这表明随着外源药物的刺激，生物体GST表达量受到抑制作用诱导作用说明此时药物已经严重破了坏肝细胞的功能。在实验的24和48h，实验结果发现，GST基因的相对表达量急剧升高（P<0.01），这可能是生物体肝细胞的解毒功能得到恢复且其解毒能力更强。之后随着时间的延长，药物在体内代谢量逐渐降低，GST基因的相对表达量恢复至对照组。各药物组在高浓度的胁迫下此反应趋势更加明显。第三部分，研究了SM2、SD和SMM三种水产用磺胺类药物对三疣梭子蟹肝胰腺组织中氨基比林N-脱甲基酶(APND)和GST活性的影响；结果表明，和对照组相比，三种磺胺类药物对三疣梭子蟹肝胰腺S9中APND活性均具有诱导作用，其中SM2诱导效应最弱，只在实验前期出现显著诱导效应(P<0.05)。而其他两种药物出现极显著的诱导效应(P<0.01)，且SD各剂量组出现一定的时间和剂量效应。而对GST活性的影响各不相同，SM2各剂量组和SD各剂量组对三疣梭子蟹肝胰腺GST活性具有诱导效应，且具有一定的时间剂量效应。但SM2各剂量组诱导效应不明显，只在前期且高浓度组出现显著诱导(P<0.05)。SD组出现极显著诱导效应(P<0.01)。SMM各剂量组中三疣梭子蟹肝胰腺GST活性前期出现诱导效应，后期则受到抑制，这与第三章中磺胺类药物对其GST mRNA表达量变化趋势相一致。