中华苜蓿根瘤菌EhuR对四氢嘧啶吸收及降解基因簇调控机制的研究

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四氢嘧啶是一类重要的相容性溶质,许多非嗜盐菌能从外界吸收四氢嘧啶作为渗透压保护剂。中华苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)通过吸收外源四氢嘧啶,除了抵抗渗透压胁迫外还能将其降解为自身提供能量。目前已知的四氢嘧啶吸收途径大部分都在转录水平或是翻译后水平上受到外界渗透压的调控,从而能够控制胞内四氢嘧啶的浓度,而中华苜蓿根瘤菌中四氢嘧啶的吸收、降解速率并非受渗透压调控,提示该菌株可能存在一个未知的四氢嘧啶吸收、降解调控途径。  本研究主要内容包括:⑴在ehuABCD-eutABCDE基因簇上游存在一个假定的转录调节基因ehuR,CDD数据库分析显示该基因编码的蛋白属于MocR/GntR家族。通过多序列比对及外源重组表达等实验重新注释了该基因的完整阅读框架。通过5-RACE和反转录实验,不仅确定了ehuR和ehuA基因的转录起始位点,还发现了ehuA除拥有自身独立的启动子外,还能与ehuR共同转录。⑵构建了ehuR的缺失及回补菌株,通过qRT-PCR、lacZ报告基因融合表达实验,发现EhuR不仅能够阻遏下游基因簇的转录,而且对自身也存在负调控作用。EMSA和DNaseⅠ Footprinting实验表明,EhuR在ehuA启动子区域存在特异性结合序列;同时也能直接结合在ehuR自身的启动子区域。将得到的3个特异性结合序列与RegPrecise数据库比对发现了一个保守的结合motif。 SPR实验证实EhuR对ehuA启动子结合强度比对ehuR自身的结合力更强,表明EhuR对ehuABCD-eutABCDE表达的调节更主要地是通过对ehuA启动子的调控实现的。⑶构建了大肠杆菌LUX报告基因系统,同时分析了四氢嘧啶降解基因簇插入失活菌株的基因表达水平,发现四氢嘧啶的降解产物发挥了解阻遏作用。在EMSA结合体系加入不同的降解产物,发现2,4-二氨基丁酸能够解除EhuR与DNA的结合。多序列比对分析发现EhuR与ehuA启动子的结合motif在几株根瘤菌中是完全保守的,说明该调控机制普遍存在于根瘤菌中。⑷针对EhuR的调控,推测出了一个较为完整的模型,为相容性溶质吸收、降解的调控机制带来了新的认识,与此同时,EhuR也是首个发现的起负调控作用的MocR/GntR家族转录调控蛋白,有助于我们进一步了解该家族蛋白的转录调控机制。
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