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药用辅料环糊精(CDs)是含有亲水性外部和疏水中心腔的环状低聚糖,由于它们具有能够与许多难溶的亲脂性分子形成水溶性包合物的独特优势,故被广泛应用于制药、纺织、农业、化妆品、化学和食品工业等领域。CDs一般由淀粉或淀粉衍生物经环糊精糖基转移酶(CGTase,EC 2.4.1.19)催化合成。CGTase属于α-淀粉酶家族,能催化四种反应:环化、偶联、歧化和水解,其中环化反应产生CDs是CGTase的特征反应,即CGTase催化淀粉的α-糖苷键裂解,一部分供体被分离出来作为受体以形成CDs。CGTase催化淀粉合成CDs,其产物通常以α-,β-和γ-CD的混合物形式存在(分别具有6、7和8个葡萄糖单元),这不利于CDs的分离纯化。因此,提高催化产物的专一性对具体种类环糊精的实际生产具有重要意义,即产物特异性。近年来提高环糊精的产物特异性一直是研究热点,主要有向反应体系中添加有机溶剂、对CGTase分子改造两种手段。本文基于来自Bacillus cereus的高效表达β-CGTase的工程菌,围绕提高其酶法合成CDs的产物特异性展开了一系列研究,建立了一种简便、高效、高选择性地合成CDs的方法,并探究了关键位点氨基酸的性质和酶催化特性之间的关系。首先,本论文对β-CGTase酶促合成CDs的催化机制进行研究,具体优化了底物淀粉的预处理方法对CDs产量的影响、酶促合成CDs的催化条件、醇类溶剂体系合成CDs的反应条件。实验结果表明底物淀粉经蒸汽处理或者糊化处理后可以大幅度提高CDs的产率;β-CGTase酶促合成CDs的最佳pH数值为8.5、最佳催化温度为55°C;催化体系中醇类溶剂的存在会影响CDs的产率和产物选择性,其中叔醇体系可以提高CDs产率(从54.95%提高到68.21%),仲醇体系显著影响产物特异性(β-CD/γ-CD:由6.25改善为8.05)。其次,采用荧光淬灭法及热力学计算探究了醇类溶剂和β-环糊精糖基转移酶的作用机理。荧光淬灭分析表明溶剂的结合常数和熵值对CDs的产率和产物特异性有影响;热力学参数揭示醇类溶剂和β-CGTase之间可能通过疏水作用力致使β-CGTase酶的结构发生了变化,从而对β-CGTase的催化特性产生影响,改变了该体系酶促合成CDs的产率和产物特异性。最后,对多种来源的CGTase的基因进行序列比对,发现Bacillus cereus来源CGTase的第47位氨基酸对CGTase合成CDs的产物特异性具有重要影响。以重组质粒pET22b/CGTase为模板,借助基因改造手段对该位置丙氨酸进行饱和突变研究,成功构建了十九株突变菌株;并通过CDs合成反应检测突变酶催化性能的改变,分析该位点氨基酸与CGTase产物特异性的关系。结果发现活性区域中第47位氨基酸位点为疏水性氨基酸时可以提高CDs(β-CD、γ-CD)的产率,而且催化产物有倾向于合成大环CDs(γ-CD等)的趋势,这说明提高β-CGTase的关键氨基酸附近的疏水作用力可能是催化合成大环CDs的有效策略。论文的研究结果进一步阐明了β-环糊精糖基转移酶的催化机制,为该酶的定向进化及实际应用提供了一定的借鉴意义。