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膀胱癌是泌尿系统常见肿瘤，发病机制目前仍未明确。尽管早期诊断、早期治疗取得了很大进展，但手术后仍有许多患者死于复发和转移。膀胱癌组织中某些生物学标志物的表达可能影响患者的预后，而根据这些特殊标志物的表达情况采取的治疗措施可能改善患者的预后，因此，寻找新的肿瘤分子标志物用于膀胱癌的早期诊断、监测病情进展、指导治疗是目前一个研究热点。畅继武教授经过多年潜心研究，根据膀胱移行细胞癌肿瘤生物学行为和形态特征变化提出两类癌概念，即Ⅰ类癌主要表现低恶性，来源于非典型增生，局限于固有膜内，容易复发；Ⅱ类癌多为高恶性，起始于结构不良，容易发生浸润转移，而且在研究中还发现Ⅰ类癌在复发后有发展成Ⅱ类癌的不良倾向。在这一概念的指导下，我们利用显微切割和基因芯片技术研究了低恶性膀胱移行细胞癌和正常膀胱黏膜基因表达谱变化，发现在低恶性膀胱癌中转录抑制因子EZH2基因表达增加，提示EZH2基因与膀胱癌的早期形成有关。EZH2基因是果蝇zeste基因增强子的人同源物，是PcG基因家族的主要成员之一，同源基因表达的重要调控因子。EZH2基因是一种转录抑制因子，在胚胎发育早期就普遍存在，参与细胞周期的调控，其高表达可以加快细胞进入S期，促进细胞的增殖。研究还发现EZH2蛋白可以抑制肿瘤转移抑制基因的活性，在许多肿瘤组织表达增加，具有促进肿瘤侵袭转移的特性，因此被认为是一个新的候选癌基因。理论上讲，阻遏EZH2基因的表达，有可能抑制肿瘤的形成和转移。如上所述，Ⅰ类癌在复发后有发展成Ⅱ类癌的不良倾向，那么EZH2是否参与了这一演变过程中?在这一演变过程中发挥什么作用，目前还不清楚。因此，以此为切人点，本研究我们将探讨EZH2基因在膀胱癌演变过程中的作用及其机制。第一部分EZH2基因在膀胱癌组织细胞的表达和临床意义我们收集49例膀胱癌组织标本和10例正常膀胱粘膜上皮标本以及36例新鲜膀胱癌组织标本和10例正常膀胱粘膜组织新鲜标本，用免疫组织化学方法和RT-PCR研究EZH2基因在不同组织类型、不同恶性程度膀胱癌组织中和正常膀胱粘膜上皮中mRNA和蛋白的表达，结合临床资料，探讨EZH2基因与膀胱癌发生发展的关系和临床意义。同时我们用RT-PCR和免疫组化方法检测EZH2基因在人膀胱癌细胞株T24、EJ是否存在EZH2的表达。结果显示膀胱癌组织EZH2蛋白的阳性表达率高于正常膀胱粘膜组织（71％vs 20％，p=0.0068）；高恶性膀胱癌组织的阳性表达率高于低恶性膀胱癌组织（100％vs 60％，p=0.014）；浸润性肿瘤EZH2的阳性表达率高于表浅肿瘤（83％vs 53％，p=0.02），EZH2 mRNA的表达也证实了上述结果，EZH2 mRNA在膀胱癌组织中的表达高于正常黏膜上皮（75％vs 30％，p=0.0082）。G3级肿瘤EZH2阳性表达率高于G1-2（，p=0.0038），T2-3肿瘤EZH2阳性表达率高于T1-2（91％vs 50％，p=0.006）同时我们的实验还证实T24、EJ细胞均有EZH2的表达。研究结果提示EZH2基因可能参与了膀胱癌的形成和演变，其表达水平在一定程度上可以反映膀胱癌的转归，有望成为新的肿瘤分子标志物用于肿瘤的早期诊断、病情检测和预后评估。第二部分EZH2 siRNA有效序列的确定、表达载体的构建以及对EJ细胞增殖的影响RNA干扰技术是近几年迅速发展起来的基因阻断技术，将与目的基因同源的小片段双链RNA分子导入细胞内，进而特异性的降解目的基因的mRNA，是基因诊断、基因治疗的有利工具。我们根据文献报道选择EZH2基因cDNA的461～481碱基为靶序列，构建EZH2-siRNA表达质粒，并研究其对人膀胱癌EJ细胞EZH2基因表达及生长抑制作用。设计shRNA对应DNA模板链，退火处理后克隆到pRNAT质粒，构建重组质粒pRNAT-EZH2-shRNA，酶切测序证实后，脂质体介导将pRNAT-EZH2-shRNA转染人膀胱癌EJ细胞株。应用RT-PCR，Western blot，免疫组化等技术检测mRNA及蛋白表达水平，MTT、平板克隆形成实验观察pRNAT-EZH2对肿瘤细胞生长活性的影响；流式细胞技术观察细胞周期变化情况。结果显示pRNAT-EZH2-shRNA抑制了EZH2基因mRNA和蛋白的表达，S期细胞比例降低，EJ细胞的增殖受到抑制。实验结果提示EZH2基因通过影响细胞周期的转化而在细胞增殖中发挥生物学作用，EZH2基因可能是膀胱癌基因治疗的有效靶点，RNAi可以成为基因治疗的有力工具。第三部分shRNA介导EZH2基因沉默后基因表达谱分析为进一步明确EZH2基因的作用机制，我们采用基因芯片技术研究了siRNA介导EZH2基因沉默后基因表达谱变化。我们采用的人22K Human Genome Array基因表达谱芯片属于寡核苷酸芯片类型，共有21522条Oligo DNA，每条Oligo DNA代表了人的一个基因转录本。将实验样品荧光标记，芯片杂交后，图象分析。结果：有436条差异表达基因，179条上调，257条下调。这些差异表达基因上传到pathway miner，有152条基因定位于已知生物学通路中，包括有EGF信号传导通路、p53传导通路、细胞增殖、细胞周期通路、notch、Wnt通路等，提示EZH2基因可能通过多条生物通路调控细胞增殖。研究中还发现EZH2基因表达抑制后，靶基因如MYT1、CNR1、WNT1等表达上调，其中多数参与了胚胎发育和细胞分化；一些细胞周期相关蛋白CDKN1A、CDKN1C、CCNE1表达下调，提示EZH2可能通过影响其下游基因的表达变化参与肿瘤的形成，EZH2基因可能是肿瘤干细胞的潜在标志物。