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猪是流感病毒重要的宿主之一,猪的呼吸道上皮细胞同时具有α-2,3和α-2,6唾液酸受体,其不仅能感染人流感病毒,而且能感染禽流感病毒,猪在流感病毒的变异、重组和跨宿主传播的过程中起着“混合器”的作用,具有重要的公共卫生学意义。我国猪流感病毒主要流行亚型为H1和H3亚型,其中欧亚类禽H1N1猪流感病毒(Eurasian avian-like H1N1,EA H1N1)在我国猪群中广泛流行并建立了稳定的遗传谱系,严重危害人类和动物的健康。本研究于2016年9月至2017年6月从屠宰场和猪场和共采集猪鼻拭子1170份,通过鸡胚和MDCK细胞分离病毒,共分离出6株猪流感病毒,分离率0.5%。分离株基因组鉴定结果表明,6株分离株均为EA H1N1亚型,内部片段具有EA、pdm/09和NTR分支的基因。遗传进化结果显示,表面基因HA和NA来源于EA分支,内部片段RNP基因来源于pdm/09,M基因分属于pdm/09和EA两个分支,NS基因属于NTR分支。根据M基因的归属划分为两个基因型,MS315、MS493和52同属一基因型M基因来源于pdm/09;FS17、MS285和SS11同属一基因型M基因来源于EA分支。根据HA基因核苷酸相似性分析和小鼠血清抗体交叉检测结果显示,6株分离株的HA基因与Sw/GD/104和Sw/GX/18进行核苷酸相似性分析,分离株52属于类Sw/GD/104的抗原类型,其余5株分离株同属于类Sw/GX/18的抗原类型,不同分离株之间小鼠血清抗体之间的交叉反应结果显示,分离株52与其它分离株的抗原交叉反应性较低(<40),其余分离株之间有较高的抗原交叉保护效价,结果与核苷酸相似性分析结果相符。分离株分子序列特性分析,6株分离株HA裂解位点位于PSIQSR↓GL,具有典型的低致病性流感病毒特征。分离株52 HA蛋白具有6个潜在糖基化位点,其余5株分离株均有5个潜在糖基化位点,在第184位缺失一个糖基化位点。分离株在抗原结合区域和受体结合区域出现个别氨基酸位点的替换,其中分离株52在Sa、Sb、Ca1和Ca2的抗原结合区域同其它5株分离株都有非同义氨基酸替换,这些氨基酸的替换可能会促使重配的猪流感病毒改变受体结合特性和抗原特性。目前EA分支的HA基因的抗原性可能出现新的进化,产生抗原特性的分化,但是这些位点中影响病毒抗原性的关键位点还需要进一步的验证。分离株的致病性氨基酸位点上,6株分离株在PA蛋白上均有P224S的突变,PB2蛋白上均具有T271A和GQ590/591SR的突变,均不具有E627K和D701N的突变。另外在NA蛋白上存在神经氨酸酶抑制剂耐药性突变H274Y。M2蛋白上存在抗金刚烷胺的耐药性位点S31N的突变。动物实验结果表明攻毒后,可在小鼠的肺脏和鼻内检测到病毒滴度,个别毒株也可以在肾脏中检测到,不同的抗原类型和基因型的毒株在小鼠上有不同的致病性。分离株52对小鼠致病力最强,其次为MS493和FS17平均体重下降在20%左右,MS285和SS11组在小鼠上只有轻微的体重下降。52属于类Sw/GD/104的抗原类型不同于其它5株分离株,这可能是分离株52具有更强致病力的原因。本试验为研究不同EA H1NA基因型和抗原类型猪流感病毒的遗传进化分子特征和对哺乳动物的致病性提供基础研究数据和参考。为研究EA和pdm/09的重组病毒的致病力与复制能力,利用反向遗传技术进行片段替换构建重组病毒。结果显示替换HA片段和构成RNP基因的4个片段,可以提高重组毒株在MDCK细胞上的复制能力,但复制能力不能恢复到亲本毒株YJ4的水平,同时替换HA基因和构成RNP基因的4个片段,其重组毒株在MDCK细胞上的复制能力恢复到与亲本毒株YJ4相接近的水平。小鼠上的动物实验同样表明同时替换HA片段与RNP复合体使重组毒株对于小鼠的致病性趋近于亲本毒株YJ4的水平。聚合酶活性结果表明来源于YJ4的PB2和PB1共同作用可以提高聚合酶活性。之后分别敲除PB2,PB1,PA和NP片段验证,结果显示替换PB1和PB2片段在MDCK上的复制能力明显降低,对于小鼠的致病性也明显的降低,替换PA和NP片段其复制能力和致病性没有降低,与r1057+HA+RNP相似。亲本毒株氨基酸位点分析表明,YJ4 HA片段上具有D222G的替换,使毒株既可以结合α-2,6受体也可以结合α-2,3受体。YJ4的PB2片段上具有T588I的替换,其单一氨基酸位点的影响还需要进一步的验证。在本研究中表明亲本毒株YJ4的HA片段和PB1以及PB2片段共同起到提高重组毒株的复制能力和致病性的作用。