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木质纤维素是自然界中蕴藏量巨大且可再生的生物资源,将木质纤维素降解成可被微生物利用的单体,再转化成燃料乙醇或其他产品已受到人们极大的关注。木质纤维素是由木质素、纤维素、半纤维素等大分子有机物结合在一起形成的一种结晶度很高的高分子有机复合物,很难被降解,需采用物理方法、化学方法或生物学方法进行预处理才能进一步被降解。白腐菌是目前唯一确认能够完全分解木质素的生物。本研究对购自CICC和ACCC的6株白腐真菌的木质纤维素降解酶系进行了比较,筛选出2株木质素酶活力较高的菌株作为菌种选育的出发菌株,通过诱变和原生质体融合,最终获得一株木质素酶组分较全且酶活较高的融合子菌株,可为相关研究开发提供参考资料和实验菌株。主要研究内容和结果如下:1.通过对6株白腐真菌降解木质素和纤维素相关酶系的比较,发现6个菌株均能产生木质素酶的三种组分,其中菌株CICC14076和CICC40719木质素酶活力较高;菌株ACCC30942能产生纤维素酶的三种组分,其余菌株纤维素酶系不全。白腐真菌木质素酶系在温度为40-50℃、pH3.5-5.0时,酶活力和酶的稳定性较高;纤维素酶系在温度为50-60℃、pH5.0-6.0时酶活力和酶的稳定性较高。依据酶活比较,选择CICC14076和CICC40719这2个菌株作为诱变育种的出发菌株。2.采用UV对CICC40719和CICC14076的孢子悬液进行诱变,以HC值为初筛依据,摇瓶发酵液酶活为复筛依据,得到漆酶活力较高的突变株UA-4-08和锰过氧化物酶、木素过氧化物酶活力较高的突变株UB-5-02。UA-4-08漆酶活力为6.22U/mL,比原始菌株CICC40719提高49.88%,方差分析差异显著;UB-5-02锰过氧化物酶和木素过氧化物酶活力分别为53.40U/mL和48.82U/mL,比原始菌株CICC14076分别提高32.47%和31.10%,方差分析差异显著。3.用NTG对CICC40719和CICC14076的孢子悬液进行诱变,以HC值为初筛依据,摇瓶发酵液酶活为复筛依据,选出漆酶活力较高的突变株NA-4-05和锰过氧化物酶、木素过氧化物酶活力较高的突变株NB-5-05。NA-4-05漆酶活力为6.12U/mL,比原始菌株CICC40719提高47.46%,方差分析显著差异;NB-5-05,锰过氧化物酶和木素过氧化物酶活力分别为49.21U/mL和43.54U/mL,比原始菌株CICC14076分别提高22.07%和16.91%,方差分析显著差异。4.选取UA-4-08、UB-5-02和NA-4-05、NB-5-05为亲本,用蜗牛酶制备原生质体,对原生质体进行UV灭活和热灭活,以PEG诱导原生质体融合,得到木质素酶综合产酶能力较强的融合子菌株F-5-07,该融合子漆酶活力8.79U/mL,锰过氧化物酶活力为57.51U/mL,木素过氧化物酶活力为58.58U/mL;木质素酶活力与融合前亲本相比差异显著。将融合子F-5-07连续传代5代,测定各代菌株3种酶的活性,结果发现传代5代,漆酶、锰过氧化物酶活力和木素过氧化物酶活力未下降;融合子菌株F-5-07在木质素酶的组分、最适作用温度、最适pH、酶对温度和pH的稳定性方面与出发菌株CICC40719和CICC14076均无明显变化。本文得出以下结论:(1)6株白腐菌中,CICC40719漆酶活力最高,CICC14076锰过氧化物酶和木素过氧化物酶活力最高;6株白腐所产木质纤维素降解相关酶类的最适作用温度在40-50℃,最适作用pH在4.0-4.5之间,在温度低于60℃,pH小于5.5的环境下,酶的稳定性较好。(2)使用UV对CICC40719和CICC14076进行诱变,获得酶活提高的突变株UA-4-08和UB-5-02。UA-4-08漆酶活力比亲本菌株提高49.87%。U-5-02锰过氧化物酶和木素过氧化物酶活力比亲本菌株分别提高 32.47%和31.10%。(3)使用 NTG 对 CICC40719 和 CICC14076 进行诱变,获得漆酶活力较高的突变株NA-4-05和锰过氧化物酶、木素过氧化物酶活力较高的突变株NB-5-05。NA-4-05漆酶活力比出发菌株提高47.47%,NB-5-05锰过氧化物酶,木素过氧化物酶活力分别比出发菌株提高22.08%和16.91%。(4)将UA-4-08,UB-5-02的原生质体进行热灭活,将NA-4-05,NB-5-05的原生质体用UV灭活,用PEG促进融合,获得木质素综合产酶能力较强的融合子F-5-07,F-5-07转接5代遗传性较稳定,F-5-07酶的特性与出发菌株CICC40719和CICC14076无差异。本文的创新点在于:(1)首次对多株白腐真菌的木质纤维素降解相关酶系的组成和酶的特性进行系统比较,可为后续菌种的开发利用提供有益的参考。(2)实验发现通过诱变可以获得酶活力显著提高的突变株,UV诱变效果优于NTG诱变。(3)将UA-4-08,BU-5-02和NA-4-05,NB-5-05的原生质体进行多亲本灭活原生质体融合,获得了漆酶、锰过氧化物酶和木素过氧化物酶产酶能力提高的融合子F-5-07,该融合子在转接5代以内遗传稳定性较好,可作为进一步研究和应用开发的实验菌株。