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急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是以快速(数小时至数天)肾功能下降为特征的常见的肾脏危重疾病,可导致多器官功能衰竭。目前尚缺乏对AKI特异性的治疗药物,因此探索AKI发病的机制,并寻找新的治疗靶点显得尤为重要。AKI主要病理特征为肾小管上皮细胞大量死亡,继而诱发后续免疫炎症反应,加重肾脏损伤。因此,抑制AKI中细胞死亡可能是减轻AKI病理损伤的关键。细胞焦亡(Pyroptosis)作为一种新型依赖Caspase-1/1 1的死亡形式,其发生速度比凋亡更快,且伴大量促炎因子释放,在肾脏炎性疾病的进展中发挥重要作用。因此,探究细胞焦亡在急性肾损伤中的作用,有利于揭示急性肾损伤的发病机制。中药及其有效成分在防治急性肾损伤有独特的优势,丹酚酸B(SalB)是活血化瘀要药丹参主要水溶性活性成分,具有较强的抗氧化作用,可保护急、慢性肾脏损伤,但其具体的作用机制仍十分不清楚。基于此,我们拟研究细胞焦亡在急性肾损伤中关键环节,及丹酚酸B(SalB)有效抑制细胞焦亡,改善急性肾损伤,拓展丹酚酸B对急性肾损伤的药理机制,为临床应用提供新的思路。目的:1.探讨细胞焦亡在缺血再灌注模型诱导的急性肾损伤小鼠中的作用及丹酚酸B对细胞焦亡的改善,初步揭示细胞焦亡与急性肾损伤的关系。2.探索丹酚酸B对Nrf2及急性肾损伤中细胞焦亡的调节作用,揭示丹酚酸B改善急性肾损伤的作用机制。3.在细胞水平进一步明确丹酚酸B通过调节Nrf2抑制焦亡,保护肾小管上皮细胞的分子机制。方法:1.丹酚酸B高中低(200、100、50mg/kg)剂量组,醋酸泼尼松组(2mg/kg)预给药7天。7天后应用单侧肾切除对侧肾动脉夹夹闭肾蒂方法制备小鼠肾缺血再灌注(IRI)AKI模型,检测小鼠24h血肌酐及尿素氮,HE染色检测小鼠肾脏组织形态表达。检测SOD,MDA,GSH反映体内氧化应激水平;免疫荧光及Western Blot检测焦亡蛋白(Caspase-1)表达变化情况,Q-PCR检测IL-1ββ和TNF-α的表达,检测NLRP3、TXNIP的蛋白表达和Nrf2/HO-1蛋白表达变化,从动物水平考察细胞焦亡在AKI中的关键作用及丹酚酸B对AKI的干预。2.建立缺氧复氧致肾小管上皮细胞(HK-2)损伤模型,给予丹酚酸B高中低(80、40、20μM)、Caspase-1 抑制剂 VX-765(50μM)和 NLRP3 抑制剂 MCC950(50μM),运用流式术检测Annexin V/PI双阳性率。同时测定细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)释放水平免疫荧光及免疫印迹法(WB)检测GSDMD、Caspase-1蛋白表达,考察焦亡对缺氧复氧损伤模型的影响及丹酚酸B的干预。Western Blot检测NLRP3、TXNIP的蛋白表达和Nrf2/HO-1蛋白表达变化,进一步验证在细胞水平Sal B保护肾小管上皮细胞的分子机制。结果:1.与IRI小鼠比较,丹酚酸B各剂量组显著抑制细胞焦亡产生炎性因子IL-1 β和TNF-a的表达,免疫组化和Western Blot结果显示丹酚酸B抑制肾组织中细胞焦亡蛋白(Caspase-1)表达,提示丹酚酸B减轻急性肾损伤中的细胞焦亡。2.与IRI小鼠比较,丹酚酸B各剂量组可有效降低血肌酐、尿素氮的含量,改善肾功能。肾脏病理显示丹酚酸B能减少蛋白管型形成,减少肾小管的损伤死亡,改善IRI小鼠的肾脏病理损伤。丹酚酸B还提高SOD、GSH的水平,降低MDA水平,抑制氧化应激反应。Western Blot结果显示丹酚酸B抑制NLRP3、TXNIP蛋白表达,提示丹酚酸B抑制了急性肾损伤中NLRP3的活化。同时,丹酚酸B促进Nrf2的入核激活,抑制Keap1的表达并促进下游HO-1蛋白的表达。以上结果提示,丹酚酸B促进Nrf2的入核激活,发挥抗氧化应激作用,同时抑制了 TXNIP的表达,抑制NLRP3的活化,改善Caspase-1依赖的细胞焦亡。3.与H/R组HK2细胞比较,丹酚酸B可有效提高细胞活力,降低MDA表达,并且减少细胞焦亡过程中LDH的释放。运用Caspase-1特异性抑制剂VX-765、NLRP3抑制剂MCC950和丹酚酸B进行干预,流式结果VX-765能有效降低HK2细胞PI双阳性率,Western Blot结果VX-765和MCC950能抑制焦亡蛋白(Caspase-1和GSDMD)表达降低,提示H/R诱导的细胞焦亡依赖NLRP3-Caspase-1活化。丹酚酸B干预后,流式结果显示丹酚酸B组HK2细胞PI双阳性率明显降低,Western Blot结果显示丹酚酸B组焦亡蛋白(Caspase-1和GSDMD)表达降低,提示丹酚酸抑制H/R诱导HK2细胞焦亡。免疫荧光和Western Blot结果显示丹酚酸B抑制NLRP3的活化和TXNIP蛋白表达,促进Nrf2的入核表达,降低Keapl蛋白表达,促进HO-1蛋白表达,提示丹酚酸B可能通过促进Keap1/Nrf2-HO1通路,发挥抗氧化作用,抑制NLRP3的活化,抑制Caspase-1依赖的细胞焦亡。结论:1.细胞焦亡促进急性肾损伤中的氧化平衡失调和炎性反应,加重疾病的发生发展。丹酚酸B能有效抑制急性肾损伤中的细胞焦亡。2.丹酚酸B有效保护IRI小鼠的肾功能,改善肾脏损伤,抑制炎症因子的分泌和氧化应激反应。丹酚酸B保护IRI小鼠可能是通过促进Nrf2的入核表达,激活Keap1-Nrf2/HO-1抗氧化通路,从而抑制Caspase-1介导的细胞焦亡。3.丹酚酸B有效提高H/R诱导HK2细胞模型的细胞活力,抑制LDH的释放,改善焦亡。丹酚酸B保护H/R诱导HK2细胞可能是通过促进Nrf2的入核表达,激活抗氧化通路Keap1-Nrf2/HO-1的表达,从而抑制Caspase-1-GSDMD介导的细胞焦亡。