Ubc9基因编码SUMO化修饰系统中唯一的E2结合酶(UBE2I)。E2结合酶可直接与SUMO分子结合并将其连接到底物蛋白上,是SUMO化修饰作用中的关键节点,在SUMO化修饰中起着重要作用。已有研究表明,Ubc9介导的SUMO化修饰会影响病毒复制。本文通过对鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)Ubc9的c DNA进行克隆、表达、分析以及蛋白亚细胞定位,EPC Ubc9上调和下调表达对CGSIV病毒的增殖和DNA复制产生的影响,筛选验证与Ubc9相互作用的病毒蛋白等,探索细胞Ubc9基因与病毒DNA复制的关系。主要结果如下:1.EPC Ubc9基因的克隆、表达、亚细胞定位以及生物信息学分析。以EPC细胞c DNA为模板,扩增得到EPC Ubc9的c DNA片段,对其进行原核表达,从而为蛋白纯化和抗体的制备准备材料。同时将EPC Ubc9在真核细胞中表达,融合蛋白Ubc9定位于环核的细胞质区。EPC Ubc9的序列结构分析和系统发育树构建结果显示,EPC Ubc9具有泛素化连接酶家族和SUMO连接酶的1个特征性保守结构域,泛素化连接酶活性位点,分泌型信号肽位点,E3相互作用残基,半胱氨酸活性位点,具有SUMO转移酶活性。Ubc9序列重建的系统发育树显示,鲤Ubc9与其他鲤形目属于一个分支,与同属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属更相似。CGSIV ORF SUMO化修饰位点的预测结果显示CGSIV ORF编码的蛋白存在着SUMO化修饰位点。2.EPC Ubc9表达的上调和下调均对CGSIV病毒的增殖和DNA复制产生的影响,同时筛选验证与Ubc9相互作用的病毒蛋白。1)过表达Ubc9促进了CGSIV病毒增殖和DNA复制。在EPC细胞中过表达Ubc9,通过荧光定量PCR和病毒滴度实验分别检测病毒DNA拷贝数和病毒滴度。结果显示过表达组较对照组平均病毒滴度和病毒DNA拷贝数均显著上调。研究证明Ubc9基因在CGSIV病毒复制过程中起到较关键的作用。而后分别在EPC细胞中转染相应载体,再用G418筛选稳定表达Ubc9的细胞系,为后期Ubc9蛋白功能研究准备材料。2)分别设计3条小干扰RNA,根据效率选择效果最好的进行RNA干扰实验。结果表明在病毒侵染3 h后,si R-343RNA干扰组相比于阴性对照组和空白对照组病毒拷贝数无明显差异;在病毒侵染48h后,si R-343RNA干扰组相比于阴性对照组和空白对照组病毒拷贝数和病毒滴度均明显下降,其差异经统计学检验上具有显著性差异。RNA干扰实验进一步证实了Ubc9蛋白参与了病毒DNA的复制。3)通过CO-IP验证Ubc9与CGSIV-PCNA的相互作用。分别将Ubc9与PCNA基因和空载共表达于Hela细胞中,转染48 h后收集蛋白,BCA测定蛋白浓度,进行IP实验,Western检测结果。结果表明Ubc9与病毒蛋白PCNA存在相互作用,病毒PCNA蛋白是病毒DNA复制相关蛋白,实验表明了Ubc9蛋白有可能通过与病毒复制相关的蛋白相互作用来影响病毒DNA的复制。