猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是一种免疫抑制性传染病病原,其危害严重制约全球养猪业发展。病毒基因组为单股正链RNA,病毒基因存在碱基突变和重组现象,我国存在多种不同的基因亚型流行毒株,包括高致病性PRRSV（简称HP-PRRSV）、类 NADC30 PRRSV（简称 NL-PRRSV）和传统 PRRSV（简称 C-PRRSV）等。病毒感染和发病严重,经济损失巨大。目前,PRRSV检测方法较多,但主要优势流行毒株的鉴别诊断方法研究不多,也缺少相应的商品化检测试剂盒。GP5蛋白是PRRSV重要免疫保护蛋白,GP5基因变异可导致病毒抗原性或毒力改变。加强PRRSV流行毒株GP5基因变异监测和建立流行毒株检测方法对疫病预防和控制具有重要意义。本研究主要研究内容如下:1.2018年我国部分地区PRRSV检测与GP5遗传变异分析采集2018年江苏、浙江、山东、安徽、上海、福建、广东、湖南、湖北、山西和河北等11个省市地区258份临床发病仔猪肺脏组织样品,采用RT-PCR检测PRRSV,结果有142份样品为PRRSV阳性,阳性率为55%。随机完成43份PRRSV 阳性样品毒株ORF5基因测序分析,结果为:43个PRRSV毒株均属美洲型,分为3个基因亚型,其中类NADC30毒株有26个,占60.5%。14个毒株属于高致病性毒株,3个毒株属于经典型毒株。GP5基因编码蛋白A抗原表位存在V29→A29的突变趋势,B抗原表位存在H38→K38的突变趋势,GP5存在糖基化位点数增多且复杂的趋势,表明我国PRRSV流行毒株正不断的变异、进化,为该病科学防治提供了理论依据。2.PRRSV通用型荧光定量PCR方法建立与应用根据PRRSV ORF7基因序列,设计出一对引物,建立了检测该病毒通用型S YBR-Green荧光定量PCR方法。该方法与猪流行性腹泻（PEDV）、猪瘟病毒（CSF V）、塞内卡病毒（SVA）、脑心肌炎病毒（EMCV）、伪狂犬病毒（PRV）和猪圆环病毒2型（PCV2）均无交叉反应;采用不同滴度PRRSV测定,当CT≤32且有明显的指数扩增曲线,判定为PRRSV 阳性,CT＞32或者无CT值则判定为PRRSV阴性。该方法检测下限为100.5TCID50病毒,高于常规RT-PCR国家标准（GB/T18090-2008）,批内和批间变异系数均小于1%。PRRSV人工感染仔猪15份肺脏组织和60份血清样品检测结果均为阳性,阴性仔猪8份肺脏组织和25份血清检测结果均为阴性。采集245份临床仔猪肺脏组织病料检测,PRRSV 阳性率为67.35%,明显高于普通RT-PCR检测阳性率（56.33%）。该方法可用于PRRSV临床病料检测。3.HP-PRRSV与NL-PRRSV双重荧光定量PCR鉴别诊断方法的建立本研究通过比对HP-PRRSV、NL-PRRSV和经典PRRSV（C-PRRSV）基因组序列,设计出针对HP-PRRSV和NL-PRRSV NSP2基因的引物和TaqMan探针,建立了可同步检测HP-PRRSV和NL-PRRSV的双重TaqMan荧光定量PCR方法。当红色扩增曲线呈现明显指数扩增,CT≤32,判定为HP-PRRSV 阳性,CT值≥34或者无CT值则判定为HP-PRRSV阴性,当32＜CT＜34且具有明显扩增曲线,判定为HP-PRRSV可疑。当绿色扩增曲线呈现明显指数扩增,CT≤33,判定为NL-PRRSV 阳性,CT值≥35或者无CT值则判定为NL-PRRSV阴性,当33＜CT＜35且具有明显扩增曲线,判定为NL-PRRSV可疑。采用病毒有限稀释方法,确定了该方法检测病毒的敏感性为101.5TCID50病毒,高于常规RT-PCR方法约100倍。该方法与C-PRRSV、猪流行性腹泻（PEDV）、猪瘟病毒（CSFV）、塞内卡病毒（SVA）、脑心肌炎病毒（EMCV）、伪狂犬病毒（PRV）和猪圆环病毒2型（PCV2）均无交叉反应。批内和批间变异系数均小于5%。采用该方法检测HP-PRRSV和NL-PRRSV人工感染仔猪48份肺脏组织,检测结果与攻毒毒株基因亚型一致。将本方法用于检测245份2017-2019年江苏和山东等5个省份的临床发病仔猪肺脏组织样品,结果显示:通用型荧光定量PCR检出165份阳性,本方法151份阳性,均属于通用型荧光定量PCR检出的阳性样品,其中91 份为 HP-PRRSV,62 份为 NL-PRRSV,2 份样品为 HP-PRRSV 和 NL-PRRSV 双阳性,证实该地区PRRSV流行毒株主要是HP-PRRSV和NL-PRRSV。本研究建立的双重TaqMan定量荧光PCR方法灵敏性高,特异性强,可用于鉴别检测临床组织样品HP-PRRSV和NL-PRRSV毒株,为该病诊断提供了更加有用的诊断方法。