目的:采用病毒分离和RT-PCR法对临床诊断为手足口病(Hand-foot-and-mouth disease,HFMD)标本进行系列检测,以对该地区手足口病的病原进行鉴定;对经微量中和试验确证的EV71分离株VP1区进行核苷酸序列测定,并将测定结果与国内外EV71毒株进行同源性分析,绘制出进化树,为手足口病防治提供科学依据,为EV71毒株基因库及分子流行病学提供可靠资料。方法:(1)采集临床诊断为HFMD患儿咽拭子和疱疹液标本共22份,采用病毒分离和RT-PCR两种方法进行检测。将待检标本按常规要求处理后接种RD细胞和HEp-2细胞,观察到特征性细胞病变后,收获病毒,采用微量中和试验和RT-PCR对分离物进行鉴定。在进行病毒分离的同时,将标本离心后,收集沉淀物进行RT-PCR。以每份标本核酸抽提物作为模板,分别用肠道病毒通用引物和EV71特异性引物进行RT-PCR扩增检测。采用统计学方法对两种标本和两种检测方法阳性率进行比较。(2)将经微量中和试验和RT-PCR扩增并测序为EV71阳性的4株分离株VP1基因进行全基因测序,所得序列与网上公布的我国深圳、武汉、台湾、阜阳的EV71流行株,以及美国、韩国、新加坡、马来西亚等国家的EV71病毒株共计15株标准基因序列的VP1蛋白基因核苷酸序列进行比对分析,构建种系进化树,并对该基因特征与分型进行分析。(3)对病毒分离和RT-PCR检测阳性患儿的年龄、性别和发病季节等一般情况,以及发热、皮疹、发热和皮疹的先后关系,有无神经系统并发症等临床表现进行了较详细的调查和分析。结果:(1)从22份咽拭子和疱疹液标本中分离出可疑肠道病毒6株,阳性率为27.3%,经微量中和试验和RT-PCR检测,以及VP1全基因测序证实分离株均为EV71病毒。VP1蛋白基因全长891bp,编码一个含297个氨基酸的蛋白,其中4株分别命名为1-4-Luan-CHN-08、14-1-Luan-CHN-08、6-6-Luan-CHN-08和19-1-Luan-CHN- 08,VP1区全基因序列与检索到的15株EV71基因相关序列进行比对,构建种系进化树。结果显示:4株分离株与EV71病毒A基因型代表株BrCr的VP1区核苷酸序列同源性为89%~96%,较为接近,差异率小于12%;与EV71病毒B、C基因型代表株比较,同源性在74%~82%,差异率在18%~26%。表明六安地区这次手足口病主要病毒流行株属于A基因型,与中国大陆其他地区流行的EV71病毒株不属于同一基因型,至今国内未见报道。(2)本次22份标本中,咽拭子和疱疹液分别为14份和8份,其中RT-PCR检测为EV71阳性的10份,阳性率为62.5%(10/16);22份标本全部进行了病毒分离,EV71阳性的6份,占27.3%(6/22),两种检测方法的阳性率有明显差别(χ2=6.35,P<0.05),RT-PCR检测阳性率远高于病毒分离阳性率。(3)经检测确证为EV71感染所致HFMD患儿8名,占57.1%(8/14),男女性别比为5:3;从年龄来看,RT-PCR检测阳性的病例除两例年龄大于4岁(分别为5岁和7岁)外,其余均为4岁以下,占75%(6/8)。HFMD发病主要集中出现在5月上旬。8例EV71感染者中,手足口臀膝皮肤黏膜表面都有不同程度的皮疹或疱疹,其中1例有轻度的脑炎症状,6例还伴有发热症状,且发现这6例热患儿中有3例表现为先出疹后发热,1例发热和出疹同时出现,2例先发热后出疹。结论:(1)本研究显示EV71是2008年六安地区HFMD流行的主要病原体,分离株属于A基因型,与中国大陆其他地区流行的EV71病毒株不属于同一基因型。而A型EV71已多年未在全球流行,必须引起高度关注。(2)咽拭子标本在用RT-PCR和病毒分离进行检测EV71时均具有较高的检出率,推荐咽拭子应作为临床标本采集时的首选标本。(3)EV71不仅可致手足口病,同时也可引起中枢神经系统症状,本研究确证为EV71感染8例患儿中,手足口臀膝皮肤黏膜表面都有不同程度的皮疹或疱疹,其中1例有轻度的脑炎症状,6例还伴有发热症状,且发现这6例热患儿中有3例表现为先出疹后发热,1例发热和出疹同时出现,2例先发热后出疹。