葡萄栓皮病是危害葡萄生产的重要病毒病害,树体一旦被病毒侵染,将终生带毒,轻者树体生长不良,产量下降,品质变劣,重者果实畸形不堪食用,失去商品价值,更甚者衰退枯死,由此造成的经济损失难以估测。迄今为止还没有一种有效的药物可以防治,目前较为可行的控制措施是实行检疫,控制其扩散。本研究的目的是建立快速、准确、实用的葡萄病毒B的检测试剂盒,以期解决种苗检疫、抗病性早期鉴定等基本问题,为葡萄无毒化栽培提供基本保障,因而葡萄病毒B的检测技术研究具有非常重要的现实意义。随机选取石河子多年生葡萄植株作为试验材料,通过研究影响总RNA提取的因素,提取出高质量的总RNA;建立葡萄病毒B两步RT-PCR体系,将扩增的特异性片段进行克隆测序,测序结果与NCBI中所提交的登陆号为X75448的核酸序列进行比对;利用克隆质粒合成cDNA探针,对随机采取的19个样品进行斑点杂交试验;在建立两步RT-PCR体系的基础之上,建立并优化了一步RT-PCR和斑点杂交优化体系,最后合成一步RT-PCR与斑点杂交检测试剂盒,并对试剂盒的特异性和稳定性进行检验。本研究的主要结论如下:1.本试验以葡萄韧皮部为试材,采用改进的SDS法提取总RNA,提取的总RNA具有带型完整、浓度高、存放时间长的优点。2.以提取的总RNA为模板,利用特异性引物进行RT-PCR反应,获得长度约为460bp的特异性片段。对特异性片段进行回收、连接、转化大肠杆菌XL1,经蓝白斑筛选后,活化细菌,提取质粒,送上海生工进行测序。测序结果经BLAST比对,特异片段的同源性可达到81%。3.利用克隆质粒,用Biotin-11-dUTP标记cDNA探针,用本试验建立起的斑点杂交体系对19个样品进行检测,其结果与两步RT-PCR检测体系是一致的。4.建立适合GVB的优化的一步RT-PCR检测体系及斑点杂交检测体系,并组装成试剂盒。5.通过对19个样品的检测,确定了试剂盒具有很好的稳定性和特异性。