疫苗是一类预防控制传染病发生流行的生物制品,在人类抗击疾病的历史中发挥了重要作用,被认为是医学科学最伟大的成就之一。依据病原,疫苗可以分为细菌性疫苗和病毒性疫苗。病毒严格细胞内寄生,基于细胞生产的疫苗是病毒疫苗的主要形式。可用于疫苗生产的细胞系包括原代细胞系:如地鼠肾细胞、鸡胚细胞;二倍体细胞系:如人二倍体细胞、猴二倍体细胞;传代细胞系:如Vero细胞等。Vero细胞是干扰素（IFN）缺陷细胞系,是大多数病毒的易感细胞系。Vero细胞生产的疫苗产量高、成本低,因此Vero细胞成为多数市售灭活病毒疫苗和减毒活疫苗的生产细胞系,如甲型肝炎疫苗、狂犬疫苗和脊髓灰质炎疫苗等。然而,Vero细胞是猴源细胞,由于携带非人类DNA残留使其在人用疫苗领域的应用存在一定的致癌风险和安全隐患。目前,一种好的解决办法是用人二倍体细胞代替Vero细胞。例如,人二倍体MRC-5细胞在许多疫苗的生产中广泛应用,由于其为人源细胞系,疫苗产品中不存在宿主细胞的非人类DNA残留,在安全性方面优势明显。但人二倍体细胞培养难度大,不易被大多数病毒感染,病毒产量很低,基于人二倍体细胞生产的疫苗价格昂贵。亚非等发展中国家狂犬病死亡人数占世界99%,却有90%以上的人只能接种纯化的Vero细胞狂犬灭活疫苗（PVRV）,而更安全的人二倍体细胞狂犬灭活疫苗（HDCV）仅在欧美发达国家广泛接种。我国同样是狂犬病感染大国,我国HDCV产量是PVRV的十分之一,价格是PVRV的10倍。我国经济的快速发展使更安全的HDCV需求量逐年增加。所以,探索和开发新一代人二倍体细胞疫苗对于我国疫苗产业的更新换代和推动疫苗的安全化进程具有深远的战略意义。目前基于人二倍体MRC-5细胞的疫苗生产模式还存在巨大的障碍和不足,本文通过比较病毒感染Vero细胞和MRC-5细胞复制水平的不同,基于对IFN应答调控机理的认识,从狂犬病毒和细胞固有免疫IFN应答的相互作用入手,采取一系列手段提高了狂犬病毒在MRC-5细胞中的复制水平,并将这种方法有效应用于狂犬灭活疫苗的中试生产中,为基于人二倍体细胞为基质的新一代疫苗的开发应用提供参考。本文主要研究结果如下:1.通过比较狂犬病毒感染MRC-5和Vero细胞在病毒复制水平和IFN应答水平上的不同,发现狂犬病毒在MRC-5细胞中的复制水平仅为Vero细胞的1/10,而IFN应答水平显著高于Vero细胞。其中病毒感染后MRC-5细胞IFN-β的相对表达量比Vero细胞高100倍以上。这提示病毒感染引起的IFN应答激活可能是导致狂犬病毒在人二倍体MRC-5细胞中复制水平低的主要原因。2.通过使用IFN应答抑制剂和IFN-α/β受体IFNAR1单克隆抗体,实现了对病毒感染后MRC-5细胞IFN应答的有效抑制。IFN应答抑制剂使MRC-5细胞IFN-β的相对表达量降低100倍左右。IFN应答抑制剂和IFNAR1单克隆抗体使狂犬病毒在MRC-5细胞中的复制分别提高10倍和5倍,其中IFN应答抑制剂组病毒复制水平和Vero细胞无显著性差异。证明了对IFN应答的抑制是提高狂犬病毒在MRC-5细胞中复制水平的有效手段。3.狂犬病毒P蛋白通过和IFN应答信号传递因子STAT1的DNA结合域相互作用,达到拮抗IFN应答的目的。本研究通过在MRC-5细胞中过表达狂犬病毒P蛋白,证明了P蛋白通过其C端功能区可以有效拮抗IFN应答。这种拮抗被过表达的P蛋白增强,使狂犬病毒在MRC-5细胞中的复制水平增加3~4倍。4.采用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功建立了IFNAR1沉默的MRC-5细胞系(MRC-5IFNAR1-),该细胞系IFNAR1基因产生移码突变,其相对表达量降低50%~70%。狂犬病毒感染后MRC-5IFNAR1-细胞系的IFN应答水平显著低于MRC-5细胞,狂犬病毒复制水平增加6~7倍。同时本研究还证明了,带状疱疹病毒和甲型肝炎病毒在MRC-5IFNAR1-细胞系中的复制水平也显著提高。该研究为MRC-5IFNAR1-细胞系在人二倍体细胞疫苗中的应用奠定了基础。5.本研究对IFN应答抑制剂和MRC-5IFNAR1-细胞系进行了60000cm~2规模的中试生产评价。结果表明:IFN应答抑制剂和MRC-5IFNAR1-细胞系分别使狂犬病毒产量增加了10倍和5倍。该研究为人二倍体细胞在狂犬灭活病毒疫苗大规模生产中的应用奠定了基础。本研究以狂犬病毒灭活疫苗生产为研究案例,在实验室和中试生产水平,证明了抑制IFN应答可以提高病毒在人二倍体MRC-5细胞中的复制水平和产量。MRC-5IFNAR1-细胞系有潜力应用于更大规模的生产,为人二倍体细胞疫苗的开发提供了新的思路,将大大推动此类疫苗的开发和应用。