研究背景中风又称脑卒中,它是严重威胁人类生命健康的重大疾病之一。调查研究显示,在我国每年脑卒中发病新增人数约250万,且呈逐年递增趋势。每年脑卒中致死人数占总死亡人数的22.45%,严重威胁人类健康,影响人们生活水平,并且给社会和家庭造成沉重的经济负担。在脑卒中病理分型中,脑梗死约占总发病人数的四分之三;在中风中医辨证证型中,气虚血瘀证最为常见。所以在进行脑血管疾病研究时应加强注重对脑梗死气虚血瘀证的研究。疾病动物模型的建立是疾病研究和中药新药研发的一个重要手段。目前,研究中常采用多因素叠加的方法来建立脑梗死气虚血瘀证病证结合大鼠模型,虽然取得了一些进展,但因建模方法和评价体系缺少规范化和标准化,且干扰因素复杂导致致病机理不容易阐明,与自然发病状态还有一定的差距,所以往往难以得到公认。因此本课题以多发性脑梗死气虚血瘀证大鼠模型为研究对象,在之前研究者研究成果的基础上进行改进并比较,尝试得出一种稳定的造模方法,并对模型评价体系进行补充和完善,同时结合本所承担的“973”课题的研究目标和内容,对此模型形成过程中机体内与气血相关的生物学指标的变化进行研究,为中药新药的研发和中药复方功效的阐述提供有价值的研究模型和手段。第一部分 多发性脑梗死气虚血瘀证大鼠模型建立方法研究1.研究目的依据中医基础理论,采用不同造模因素探讨多发性脑梗死气虚血瘀证病证结合大鼠模型的建立方法。2.材料和方法将SD雄性大鼠随机分为5组:A.正常组:正常饮食、饮水5周,n=11;B.假手术组:仅切口、穿线,不注射荧光微球,其他同正常组,n=11;C.单纯睡眠剥夺组(睡夺组):每天睡眠剥夺16h(每天16点至次日8点),共剥夺5周,n=11;D.单纯多发性脑梗死组(脑梗组):于正常饲养1周后行多发性脑梗死手术,术后继续正常饲养4周,n=12;E.睡眠剥夺复合多发性脑梗死组(睡夺+脑梗组):每天睡眠剥夺16h(每天16点至次日8点),睡眠剥夺1周后行多发性脑梗死手术,术后继续睡眠剥夺4周,n=12。术后4周(睡眠剥夺5周)观察大鼠一般表征状态,分别采集大鼠体重,抓力,负重力竭游泳时间,自发活动路程,脉搏幅度等气虚指标;分别采集和测定大鼠舌面图像R、G、B值,血液流变学,凝血四项等血瘀指标;分别采集大鼠神经功能缺损情况评分(分别于术后24h和术后4周后各采集一次),大鼠脑表面荧光微球分布情况图片,脑切片梗死区域分布情况图片(于术后24h采集),脑组织病理及超微结构观察等多发性脑梗死疾病指标;测定脑组织匀浆液中MDA含量以及SOD、Na+-k+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性等指标。3.研究结果(1)一般状态观察:正常组和假手术组大鼠一般状态良好,三个模型组大鼠均出现一定程度的懒动,精神萎靡的现象,其中睡夺+脑梗组较其它两个模型组情况更严重。(2)气虚指标:与假手术组比较,三个模型组体重、负重力竭游泳时间、自发活动路程、抓力和脉搏幅度均有不同程度减少(P<0.05或P<0.01)或有下降趋势(脑梗组体重);与睡夺组和脑梗组比较,睡夺+脑梗组体重、负重力竭游泳时间、自发活动路程、抓力和脉搏幅度均显著减少(P<0· 05或P<0.01)。(3)血瘀指标:①舌面图像R、G、B值:与假手术组比较,三个模型组舌面图像R、G、B值均显著减少(P<0.01);与睡夺组和脑梗组比较,睡夺+脑梗组大鼠舌面图像R、G、B值均显著减少(P<0.05或P<0.01)。②血液流变学:与假手术组比较,三个模型组在切变率5 s-1下的全血黏度均明显增加(P<0.05),睡夺+脑梗组在切变率60s-1下的全血黏度明显增加(P<0.05);三个模型组之间在各切变率下的全血黏度无明显差异。③凝血四项:与假手术组比较,睡夺组TT明显减少(P<0.05),脑梗组和睡夺+脑梗组PT、APTT、TT均明显减少(P<0.05或P<0.01);与睡夺组和脑梗组比较,睡夺+脑梗组PT明显减少(P<0.05)。(4)脑梗死疾病指标:①神经功能缺损情况评分:术后24h和术后4周,脑梗组和睡夺+脑梗组大鼠均出现神经功能缺损情况,术后24h,两组神经功能缺损情况评分无显著差异;术后4周,睡夺+脑梗组神经功能缺损情况评分显著高于脑梗组(P<0.01)。②脑表观与脑切片TTC染色观察:术后4周脑梗组和睡夺+脑梗组大脑均出现荧光微球散状分布,且局部出现坏死区域;术后24h大脑切片右半脑均有面积不等的白色梗死区域。③脑组织病理及超微结构观察:通过脑组织HE染色和电镜观察可见,正常组和假手术组脑组织结构正常,睡夺组脑组织结构基本正常,脑梗组和睡夺+脑梗组脑组织结构出现明显病理性改变。(5)生化指标:与假手术组比较,三个模型组脑皮层MDA含量均显著增加(P<0.05 或P<0.01),SOD、Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-ATP酶活性均显著降低(P<0.05或P<0.01);与睡夺组和脑梗组比较,睡夺+脑梗组大鼠脑皮层MDA含量明显增加(P<0.05),SOD、Na-+KC-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性均显著降低(P<0.05 或P<0.01)。4.结论单纯证候造模,即长时间睡眠剥夺可以使大鼠出现气虚血瘀证候表现,但尚不能达到脑梗死疾病病理改变;而单纯疾病造模,则主要反映临床病理变化,缺少与中医理论的关联,尚不能完整体现中医证候特征或与特定的中医证候等同;采用复合因素(睡眠剥夺+脑梗死)建立的模型综合了两者的技术优势,与中医理论紧密关联,与病证结合动物模型的特征相符合,与临床疾病发生发展的过程更接近,能够完整体现中医证候特征,有助于阐释中医证候的科学内涵和理论基础。上述气虚、血瘀、疾病、能量代谢、病理观察等多项指标结果的综合分析,也证明复合因素(睡眠剥夺十脑梗死)造模优于单纯疾病造模和单纯证候造模,是一种稳定、可控且重复性较好的多发性脑梗死气虚血瘀证病证结合大鼠模型。第二部分 多发性脑梗死气虚血瘀证大鼠模型病理生理演化过程及益气活血方干预的研究1.研究目的观察采用复合因素建立的病证结合模型在不同时间点各指标的变化,研究模型病理生理演化过程,并用益气活血方进行干预,探讨模型建立方法的稳定性和可靠性。2.材料和方法将雄性SD大鼠随机分为4组,分别为正常组,假手术组,睡眠剥夺复合多发性脑梗死模型组,益气活血方组。正常组:正常饮食、饮水,同时与假手术组同步按照10ml/kg灌胃蒸馏水,每天1次,连续4周,n=31;假手术组:仅切口、穿线,不注射荧光微球,术后开始灌胃蒸馏水,其他同正常组,n=31;睡眠剥夺复合多发性脑梗死组(睡夺+脑梗组):每天睡眠剥夺16h(每天16点至次日8点),睡眠剥夺1周后行多发性脑梗死手术,术后继续睡眠剥夺4周,并于术后开始每天按照10ml/kg灌胃蒸馏水,每天1次,连续4周,n=30;益气活血方组:每天睡眠剥夺16h(每天16点至次日8点),1周后行多发性脑梗死手术,术后继续睡眠剥夺4周,并于术后开始每天按照10ml/kg灌胃益气活血方(26g生药/kg)1次,连续给药4w,n=30。术后分三个时间点(术后48h、术后2周、术后4周)从每组随机选取10只大鼠进行相关指标测定。每阶段造模结束后检测指标和方法同第一部分实验,新增LD、LDH、TXB2、6-keto-PGF1α.5-HT五项指标测定。3.研究结果:(1)一般状态观察:正常组和假手术组大鼠三个时间点的一般状态良好,模型组和益气活血方组大鼠三个时间点均出现不同程度的精神萎靡,懒动的状态,模型组大鼠随造模时间延长情况愈加严重,益气活血方组大鼠一般状态较模型组有明显改善。(2)气虚指标:与假手术组比较,模型组体重、抓力、负重力竭游泳时间、自发活动路程、脉搏幅度均显著减少(P<0.01);与模型组比较,益气活血方组术后4周体重、抓力、负重力竭游泳时间、自发活动路程、脉搏幅度均显著上升(P<0.05或P<0.01)。(3)血瘀指标:①舌面图像R、G、B值:与假手术组比较,模型组三个时间点舌面图像R、G、B值均显著减少(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,益气活血方组术后48h舌面图像RG、B值均无明显差异,术后2周舌面图像R值显著增加(P<0.01),G、B值无明显差异,术后4周舌面图像R、G、B值均显著增加(P<0.05)。②血液流变学指标:与假手术组比较,模型组三个时间点在切变率5 s-1、60 s-1、150 s-1下的全血黏度均明显增加(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,益气活血方组术后2周在切变率5 s-1、60 s-1下的全血黏度均显著降低(P<0.01),术后4周在切变率5 s-1下的全血黏度明显降低(P<0.05)。③凝血四项指标:与假手术组比较,模型组术后2周、4周PT、APTT、TT均明显减少(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,益气活血方组术后2周、4周PT、TT均明显增加(P<0.05或P<0.01)。(4)脑梗死疾病病理指标:①神经功能缺损情况评分:模型组三个时间点均出现神经功能缺损情况;与模型组比较,益气活血方组术后48h和术后2w神经功能缺损评分无明显差异,术后4w神经功能缺损情况评分有减少趋势。②脑表观与脑切片TTC染色观察:模型组和益气活血方组大鼠右半脑三个时间点均出现荧光微球散状分布,且有局部坏死,早期有水肿区域,益气活血方组水肿、坏死程度轻于模型组;③脑组织病理及超微结构观察:通过脑组织HE染色和电镜观察可见,正常组和假手术组脑组织结构正常,模型组脑组织结构出现明显的病理性改变,且随着造模时间延长不断加重,益气活血方组脑组织结构病变较模型组明显减轻。(5)生化指标测定:与假手术组比较,模型组三个时间点脑皮层SOD、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性均明显降低(P<0.05或P<0.01),LDH活性明显升高(P<0.01),脑皮层MDA、LD、血清TXB2含量均明显增加(P<0.01),血清6-keto-PGF1a、脑皮层5-HT含量均明显减少(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,益气活血方组术后2周5-HT含量明显增加(P<0.05),术后4周Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性均明显升高(P<0.05),LDH活性明显降低(P<0.01),LD、MDA、TXB2含量均明显减少(P<0.05 或P<0.01),6-keto-PGF1α和 5-HT 含量均明显增加(P<0.05)。4.结论(1)采用睡眠剥夺复合脑梗死手术,建立多发性脑梗死气虚血瘀证大鼠模型,观察并分析了模型发展不同时间点各项指标的变化特点,初步揭示了模型气虚血瘀证候的演化过程及相关生物学基础。(2)益气活血方对多发性脑梗死气虚血瘀证大鼠模型有较好疗效,主要体现在对模型大鼠的一般表征、气虚血瘀状态、能量代谢障碍、血液流变性、凝血功能、脑组织病理改变等方面均有较好的改善作用,验证了所建立的病证结合模型的稳定性和可靠性。综上所述,本文比较了不同因素造模方法,明确了睡眠剥夺复合脑梗手术的方法适合于建立多发性脑梗死气虚血瘀证大鼠模型,观察并分析了模型发展不同时间点各项指标的变化特点,并利用益气活血方进行干预,对所建立的病证结合模型的稳定性和可靠性进行了验证,初步揭示了模型气虚血瘀证候的演化过程及生物学基础,为中药新药的研发和中药复方功效的阐述提供了有价值的研究模型和手段。