论文部分内容阅读
背景甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)是最常见的内分泌肿瘤,其发病率占恶性肿瘤的3%左右。近年来全球报道甲状腺乳头状癌的发病率持续增高,最新研究显示我国甲状腺乳头状癌的10年生存率仅为67.5%,而局部的侵袭转移是影响预后的主要因素。微小RNA(miRNA)是一种真核生物特有的内生性RNA,它是非编码的单链RNA,全长约为21-25个核苷酸。miRNA可以识别并调节信使RNA的转录,调节相关基因的表达,促进降解和抑制翻译过程,从而调控细胞和组织的生长、增殖、分化、凋亡等过程。大量研究发现,miRNA通常位于肿瘤相关的染色体部位,其异常表达与肿瘤的发生、发展、侵袭、转移密切相关。我们在前期通过高通量的MicroRNA微阵列生物芯片技术筛查了甲状腺乳头状癌组织和正常甲状腺组织中miRNA的差异表达谱,对表达有差异的miRNA进行验证,筛选出一些与甲状腺乳头状癌相关的miRNA,其中miRNA-146b-5p呈顺序上调最显著。进一步研究发现,随着甲状腺乳头状癌分期的增加,miRNA-146b-5p的表达水平明显升高,提示其在甲状腺乳头状癌发生、发展中起重要作用。但是miRNA-146b-5p与甲状腺乳头状癌的侵袭转移是否有关系,它通过什么机制来促进甲状腺乳头状癌的发展尚不清楚。因此,深入探讨miRNA-146b-5p对甲状腺乳头状癌生物学行为的影响及机制研究具有重要意义。目的研究miRNA-146b-5p与甲状腺乳头状癌细胞侵袭转移的关系,并进一步探讨其机制。方法1.构建miRNA-146b-5p过表达慢病毒质粒,将过表达慢病毒质粒转染至人甲状腺乳头状癌细胞TPC-1中,获得稳定转染的细胞单克隆,RT-PCR检测转染组细胞miR-146b-5p的表达。划痕实验观察转染组、空载体组和对照组细胞迁移能力,transwell小室侵袭实验观察三组细胞的侵袭能力。2.利用生物信息技术预测miRNA-146b-5p的靶基因,双荧光素酶报告验证靶基因;应用Western blot及RT-PCR分别检测转染组、空载体组和对照组细胞中β-catenin、Axin和APC蛋白和mRNA的表达;应用NF2阻断转染组细胞中Wnt/β-catenin信号通路后,分别利用划痕实验和transwell小室侵袭实验观察阻断组和对照组两组细胞的迁移和侵袭能力。3.Western blot及RT-PCR分别检测转染组、空载体组和对照组细胞中上皮-间质转化的相关因子E-cadherin、N-cadherin和Vimetin蛋白及mRNA的表达;Western blott及RT-PCR分别检测阻断组和对照组细胞中EMT信号通路的相关因子E-cadherin、N-cadherin和Vimetin蛋白及mRNA的表达。结果(1)RT-PCR结果显示与空载体组和对照组相比转染组细胞中的miRNA-146b-5p mRNA表达明显增高。划痕实验结果显示转染组48h迁移细胞数量均高于空载体组和对照组(P<0.05);transwell小室侵袭实验结果显示转染组48h的穿膜细胞均高于空载体组和对照组(P<0.05)。(2)生物信息技术预测NF2可能是miRNA-146b-5p的靶基因;双荧光素酶报告结果显示NF2是miRNA-146b-5p的靶基因;Western blot结果显示与空载体组和对照组相比转染组细胞中β-catenin蛋白表达升高、Axin蛋白和APC蛋白表达下降(P<0.05);RT-PCR结果显示与空载体组和对照组相比转染组细胞中β-catenin mRNA表达升高、Axin mRNA和APC mRNA表达下降(P<0.05)。划痕实验结果显示阻断组48h迁移细胞数量明显少于对照组(P<0.05),transwell小室侵袭实验结果显示阻断组48h的穿膜细胞明显少于对照组(P<0.05)。(3)Western blot结果显示与空载体组和对照组相比转染组细胞中E-cadherin蛋白表达下降,N-cadherin蛋白和Vimetin蛋白表达升高(P<0.05);与对照组相比阻断组细胞中E-cadherin蛋白表达升高,N-cadherin蛋白和Vimetin蛋白表达下降(P<0.05);RT-PCR结果显示与空载体组和对照组相比转染组细胞中E-cadherin mRNA表达下降,N-cadherin mRNA和Vimetin mRNA表达升高(P<0.05);与对照组相比阻断组细胞中E-cadherin mRNA表达升高,N-cadherin mRNA和Vimetin mRNA表达下降(P<0.05);结论1、miRNA-146b-5p通过调控靶基因NF2激活Wnt/β-catenin信号通路,促进TPC-1细胞侵袭迁移2、miRNA-146b-5p促进TPC-1细胞侵袭迁移过程中发生了上皮-间质转化。3、增强抑癌基因NF2的表达可以抑制Wnt/β-catenin信号通路,过表达miRNA-146b-5p的TPC-1细胞上皮-间质转化出现逆转。